基于透明標(biāo)本研究巴西紅耳龜幼體骨骼系統(tǒng)

黃鳴翔，郭 婷，荊 洵，黃誠(chéng)彧，周 玲，劉 敏

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

巴西紅耳龜(Red-eared slider，Trachemysscriptaelegans)，在動(dòng)物界屬龜鱉目澤龜科滑龜屬，是水棲龜，頭側(cè)中部的鼓膜上有桔紅色或暗紅色的橢圓形斑[1]。透明標(biāo)本是用化學(xué)和物理的方法，使軟組織的折光率和透明劑的折光率相近，從而使軟組織透明，骨組織清晰顯現(xiàn)[2]。巴西紅耳龜幼體骨塊比較小，骨與骨之間的軟骨成分比較多，不易于做成骨骼標(biāo)本，且尚未發(fā)現(xiàn)通過制作龜透明標(biāo)本來研究骨骼系統(tǒng)的報(bào)道。故本試驗(yàn)擬采用透明標(biāo)本制作技術(shù)來研究巴西紅耳龜幼體的整體骨骼形態(tài)結(jié)構(gòu)以及各骨塊之間的位置關(guān)系，既可建立巴西紅耳龜透明標(biāo)本的制作方法，又可確定其骨骼系統(tǒng)的解剖學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 幼齡期的巴西紅耳龜。

1.2 試劑及工具 1%氫氧化鉀(KOH)、茜素紅溶液、3%過氧化氫(H2O2)、梯度(25%、50%、75%和100%)丙三醇、解剖刀柄、刀片、眼科鑷子、量筒、容量瓶及廣口瓶等。

1.3 制作方法

1.3.1 處理材料 將龜放入充滿乙醚的容器中，使其吸入過量乙醚致死。用解剖刀在龜?shù)暮笾つw上切一個(gè)5～8 mm的口子，用鑷子將內(nèi)臟全部取出。

1.3.2 固定 將標(biāo)本放入95%的乙醇中固定7 d，用玻璃板壓住，使其完全浸沒，隔2～3 d換液。

1.3.3 脫脂 將固定后的標(biāo)本移入丙酮中，脫脂3 d。

1.3.4 透明 使用1% KOH將標(biāo)本浸泡3～5 d，至肌肉及龜殼呈半透明狀，并將龜殼上的角質(zhì)盾片剝落。

1.3.5 染色 移至飽和茜素紅溶液中，骨骼被染為紫紅色為止，約3～5 d。

1.3.6 脫浮色 移至3% H2O2中脫浮色，能清晰看到骨組織紫紅色為止，一般需要2～3 d。

1.3.7 梯度透明 依次移入25%、50%及75%的丙三醇中各浸泡3 d，至無多余的顏色浮出、骨組織清晰可見為止。

1.3.8 保存 移入100%的丙三醇中進(jìn)行保存。

2 結(jié)果

2.1 染色結(jié)果分析 本試驗(yàn)制作的巴西紅耳龜透明標(biāo)本，形態(tài)完整染色均勻，可觀察到巴西紅耳龜?shù)念^部、四肢、龜殼、尾部、身體中部被茜素紅染成了紅色，說明這些部分含有能夠與茜素紅特異性結(jié)合的鈣成分，為硬骨組織，其余的部分則透明無浮色，為軟骨組織、肌組織和其他結(jié)締組織。見中插彩版圖1、2。

2.2 骨骼系統(tǒng)觀察 本試驗(yàn)通過制作透明骨骼標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)巴西紅耳龜骨骼可分為頭骨、脊柱、肋骨和附肢骨。同時(shí)，龜鱉目是爬行綱中最為特化的一類，背腹具殼，是一種被動(dòng)的保護(hù)性適應(yīng)[6]。

2.2.1 頭骨 面區(qū)短而窄，眼后則顯著擴(kuò)大，整個(gè)頭骨較寬而扁平(見中插彩版圖1A)。

2.2.2 脊柱 包括頸椎、軀椎、薦椎和尾椎。頸椎未與龜殼愈合，但由于龜殼的遮擋，頸椎無法清楚的觀察到。軀椎與背部的髓板愈合，髓板是骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)，會(huì)被茜素紅染上顏色，覆蓋在軀椎上。薦椎遠(yuǎn)端的膨大與腰帶相連。尾椎有20枚左右，從前往后逐漸變小。

2.2.3 肋骨 龜類的肋骨數(shù)比較少，其中有8對(duì)緊密愈合于背殼的肋板。見中插彩版圖1A，可以清晰看到與肋板愈合的8塊肋骨和薦尾椎相連的比較小的肋骨，且中間的肋骨較長(zhǎng)，兩邊的肋骨較短。

2.2.4 附肢骨 (1)前肢骨：分為肱骨、橈骨、尺骨、腕骨、掌骨和指骨(見中插彩版圖1B)。①肱骨粗壯，彎成弓形，中段稍圓，兩端微隆。②橈骨與尺骨并列，遠(yuǎn)端比近端略寬。尺骨較橈骨略微粗壯，近端比遠(yuǎn)端略寬(見中插彩版圖1B)。③腕骨為不規(guī)則顆粒狀，互相嵌合(見中插彩版圖1B)。④掌骨有5枚，圓片狀，前凹形。⑤指數(shù)13枚，各排指骨數(shù)為2、3、3、3、2(見中插彩版圖1B)。(2)后肢骨：分為股骨、脛骨、腓骨、跗骨、跖骨、趾骨(見中插彩版圖2B)。①股骨略彎，中段細(xì)圓，兩端擴(kuò)大。②脛骨與腓骨并列，腓骨比脛骨細(xì)弱，中間靠合形成長(zhǎng)條形的間隙，遠(yuǎn)端與跗骨相接(見中插彩版圖2B)。③跗骨中包括距骨和跟骨，脛骨一側(cè)為距骨，腓骨一側(cè)為跟骨，較小。④跖骨5根，粗細(xì)長(zhǎng)短不一，第1根較粗，第4、5根較短(見中插彩版圖2B)。⑤趾骨13枚，各排的數(shù)目為2、3、3、3、2(見中插彩版圖2B)。

2.2.5 龜殼 龜殼由背部和腹部組成：背殼和腹殼。(1)背殼：向外凸的橢圓形。從中插彩版圖1 A和1C中可清晰發(fā)現(xiàn)背殼有3列骨板：①圍在邊緣的11對(duì)緣板；②由前至后順背中線排列的，近方形的一列髓板，大部分與下面的脊椎愈合。髓板的最前面一塊稱為頸板，最后一塊又稱為臀板或者后髓板；③位于緣板和髓板之間，長(zhǎng)方形的8對(duì)肋板，排列為左右兩列并與下面肋骨緊密聯(lián)合。(2)腹殼：平板狀，腹殼骨板是由成對(duì)的上腹板、舌腹板、下腹板、劍腹板以及前中位的單塊內(nèi)腹板構(gòu)成(見中插彩版圖2A、2C)。

3 小結(jié)

3.1 本試驗(yàn)通過與四爪陸龜[4]、幼發(fā)拉底河軟殼龜[5]的骨骼系統(tǒng)相比較，通過透明標(biāo)本的制作和觀察驗(yàn)證了巴西紅耳龜?shù)墓趋老到y(tǒng)與其他龜類大體相同。均可見頭骨、脊柱、肋骨、附肢骨和龜殼。龜殼可分為背殼和腹殼，背殼中包含軸向骨骼元素：軀椎和肋骨[7]。脊柱包括頸椎、軀椎、薦椎和尾椎。附肢骨包括肩帶、前肢骨、腰帶、后肢骨等[4]。巴西紅耳龜?shù)牟糠止趋罃?shù)目與其他龜類仍有一些差異。其掌骨和跖骨均為5枚，指(趾)骨均為13枚。幼發(fā)拉底河軟殼龜掌骨和跖骨為5枚，指骨17枚，趾骨15枚[5]。四爪陸龜?shù)恼乒呛王殴菫?枚，指骨6枚，趾骨8枚[4]，各指(趾)的節(jié)數(shù)略有差異。

3.2 在以往文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)龜類透明標(biāo)本制作的相關(guān)信息，根據(jù)劉萬勝等[9]研究結(jié)果進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)了一套較合理的制作巴西龜幼體透明標(biāo)本的方法。(1)用梯度乙醇(75%，85%，95%)脫水要比直接用95%的乙醇脫水效果好，能降低劇烈脫水對(duì)龜身體造成的傷害。(2)脫脂要充分，否則會(huì)影響后面步驟透明的效果。(3)透明的時(shí)間需視情況而定。過長(zhǎng)會(huì)使骨骼松散，過短則影響染色效果。在透明的過程中，龜殼外層的角質(zhì)盾片會(huì)被軟化脫落。(4)巴西紅耳龜較難染上色，所需時(shí)間稍長(zhǎng)，一般是3～5 d。不要將茜素紅配置成過飽和，會(huì)使標(biāo)本染色過深，導(dǎo)致后續(xù)步驟脫浮色困難。(5)不同于雛雞、青蛙等透明標(biāo)本制作[8-9]采用的脫浮色試劑(梯度酒精和梯度丙三醇)，我們發(fā)現(xiàn)H2O2脫浮色效果更好，周期更短。缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生氣泡，可以用注射器抽取消除。

3.3 本試驗(yàn)制作的標(biāo)本頭骨染色不太清晰，難以具體辨認(rèn)頭骨各部位?？赡苁窃诎胪该?、染色和脫浮色這一系列過程中，標(biāo)本未用重物固定好，導(dǎo)致標(biāo)本頭部漂起，未完全沒入液面，未經(jīng)歷這些步驟或經(jīng)歷時(shí)間不夠。另外，有些骨位于龜殼內(nèi)，部分結(jié)構(gòu)被龜殼或肌肉遮擋，難以觀察其完整結(jié)構(gòu)和確定其數(shù)目。如標(biāo)本肩帶(肩胛骨、烏喙骨)、腰帶(髂骨、坐骨、恥骨)、頸椎、軀椎、尾椎等。

龜作為一種較難以普通解剖方法進(jìn)行骨骼研究的生物，尤其幼體骨骼發(fā)育不充分且個(gè)體較小[10]。透明標(biāo)本這一種標(biāo)本制作方法為研究動(dòng)物龜幼體骨骼系統(tǒng)提供了實(shí)踐基礎(chǔ)，為胚胎學(xué)、解剖學(xué)提供了直觀而清晰的形態(tài)學(xué)素材。其應(yīng)用方面較為廣泛，值得在研究中不斷進(jìn)行嘗試改進(jìn)。