豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白GP3 調(diào)節(jié)Claudin 4促進其早期感染的分子機制研究

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PRRSV 基因組具有高變異性，新的變異株不斷出現(xiàn)，致使現(xiàn)有疫苗保護力不理想；加之缺乏有效藥物，其致病機制也不完全清楚，使得該病更加難以防控。

緊密連接（TJ）是相鄰細胞之間特化形成的連接結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)細胞旁通透性，參與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。TJs 由40 多種不同的蛋白質(zhì)組成，其中閉合蛋白（Occludin，OCLN）、密封蛋白（Claudins，CLDNs）和連接黏附分子是3 種主要類型的組成蛋白質(zhì)。CLDN 是構(gòu)成TJ 結(jié)構(gòu)的主要蛋白，決定著水和離子的通透性。作為細胞之間緊密的物理屏障，CLDN 有助于抵御病毒感染，并被某些病毒劫持以促進其感染，例如丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、呼吸道合胞體病毒等。近期，《Journal of Virology》發(fā)表了“Porcine reproductive and respiratory syndrome virus structural protein GP3 regulates claudin 4 to facilitate the early stages of infection”的研究論文。該研究顯示，PRRSV 感染的早期下調(diào)細胞中CLDN4的表達，后期則上調(diào)CLDN4 的表達，提示CLDN4在PRRSV 感染過程中可能起到非常重要的作用。進一步研究顯示將CLDN4 敲低/敲除后能夠顯著促進PRRSV 的感染，而CLDN4 過表達則顯著抑制PRRSV 的感染，這些結(jié)果表明CLDN4 可以抑制PRRSV 感染。通過構(gòu)建CLDN4敲除和過表達的細胞系，通過抗體阻斷、熒光定量PCR 和western blot等試驗，發(fā)現(xiàn)CLDN4 可以抑制PRRSV 的吸附。免疫沉淀試驗結(jié)果顯示PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP3 的C 末端與CLDN4 的小細胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域（ECL2）具有相互作用。人工合成的ECL2 多肽可以顯著抑制病毒的吸附，從而抑制PRRSV 的感染，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

為了進一步揭示PRRSV 感染早期下調(diào)CLDN4表達的機制，該研究克隆了CLDN4 的啟動子區(qū)域及所有PRRSV 蛋白的真核表達質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報告基因試驗檢測，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)蛋白GP3 可以下調(diào)CLDN4的啟動子活性，同時通過western blot 鑒定了GP3 可以下調(diào)CLDN4 的表達。為了探究GP3 如何調(diào)控CLDN4基因的轉(zhuǎn)錄，通過western blot 等方法鑒定了PRRSV 感染可以下調(diào)CLDN4基因轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達，敲低SP1 可以抑制CLDN4 的表達并促進病毒復(fù)制。進一步的研究顯示GP3 蛋白可以提高SP1的泛素化水平，促進SP1 降解，從而下調(diào)CLDN4基因的轉(zhuǎn)錄，最終有利于PRRSV 吸附易感細胞，促進其感染。在此基礎(chǔ)上提出了PRRSV 與CLDN4 相互作用的模型，即感染早期，少量PRRSV 與受體結(jié)合進入細胞，表達的GP3 使調(diào)控CLDN4基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子SP1 泛素化而被降解，從而下調(diào)CLDN4基因的轉(zhuǎn)錄和表達。少量表達的CLDN4 又促使大量的病毒顆粒進入細胞。

該研究結(jié)果闡述了PRRSV 的GP3 蛋白下調(diào)CLDN4 表達，促進PRRSV 早期感染細胞的機制；CLDN4 的ECL2 能夠有效的抑制PRRSV 感染，為新的治療性抗PRRS 藥物的研制提供了新的思路。