金葡菌感染引發(fā)的天然免疫防御效應研究進展①

石 婷 李甜甜 鄭月娟

(上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，上海中醫(yī)藥大學上海市健康辨識與評估重點實驗室，上海 201203)

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus，S.aureus)簡稱“金葡菌”，屬于革蘭氏陽性(gram positive，G+)球菌，是引起院內(nèi)和社區(qū)感染最常見的化膿性病原菌，寄居于人體的鼻腔、咽喉、肺、皮膚及腸道內(nèi)，當機體免疫狀態(tài)低下時可引發(fā)皮膚或軟組織感染，如毛囊炎、蜂窩織炎、皮下膿腫或潰瘍，入血后可導致菌血癥、肺炎、腦膜炎、骨髓炎、膿毒血癥等重癥感染，嚴重威脅人類生命健康[1-3]。臨床分離到的G+致病菌中，金葡菌的檢出率位居第一[4]。目前抗生素仍然是臨床抗感染治療的首選藥物。但近年抗生素濫用導致了金葡菌多重耐藥性的不斷進化。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，MRSA)對多種臨床一線抗生素耐藥，導致臨床治療陷入窘境[5]。據(jù)2016年世界抗生素耐藥情況調(diào)查統(tǒng)計，全球每年約70萬人死于抗生素耐藥性細菌感染，MRSA是其主要危險因素之一。2017年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測報告結(jié)果顯示，MRSA的臨床平均檢出率連續(xù)5年持續(xù)超過30%，已成為致死風險最高的致病菌之一[4,6]。目前，萬古霉素是臨床治療MRSA感染的一線抗生素，但日漸增多的萬古霉素耐藥株提高了臨床抗MRSA感染治療的復雜性[5，7-9]。盡管近年針對MRSA的新型抗生素研發(fā)已取得一定進展，但為防止新型抗生素耐藥菌的產(chǎn)生，尋找新的治療策略具有重要意義。

機體針對病原菌產(chǎn)生適度的免疫應答可有效清除病原菌。但機體免疫反應過弱不利于病原菌清除，機體免疫反應過強，則會引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，導致機體組織損傷、多器官功能衰竭、膿毒癥，甚至死亡。宿主導向治療(host-directed therapy，HDT)是近年抗感染領(lǐng)域出現(xiàn)的新方法，通過調(diào)控感染過程中宿主過強的免疫反應，減少感染引發(fā)的過度炎癥因子分泌，減少組織臟器損傷，避免耐藥，從而保護機體、改善預后[10,11]。

金葡菌感染宿主是雙方相互作用的動態(tài)過程，對宿主的致病性一方面取決于病原菌本身，另一方面取決于宿主免疫反應。金葡菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素(如溶血素、剝脫毒素、腸毒素、致熱性外毒素、殺白細胞素和中毒性休克綜合征毒素等)和侵襲性酶(如：血漿凝固酶)。為適應環(huán)境變化，金葡菌分泌胞外復合物形成生物膜包裹自身，附著在生物或者非生物表面，使膜內(nèi)細菌逃避機體免疫系統(tǒng)的作用，同時阻止或延緩抗生素滲透。在抗感染過程中，宿主的天然免疫系統(tǒng)是機體發(fā)揮免疫防御效應的第一道防線，并啟動獲得性免疫。中性粒細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞(macrophage，Mφ)、肥大細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)、γδ T細胞和固有淋巴樣細胞(innate lymphoid cell，ILC)等是參與感染性疾病的重要天然免疫細胞。當病原菌入侵機體時，宿主的天然免疫細胞被迅速募集并激活，引發(fā)免疫應答反應。一方面可誘導機體產(chǎn)生促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1、IL-6等以及趨化因子，如單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2),促進中性粒細胞和Mφ向感染部位聚集，并增強其吞噬功能[12，13]。另一方面，Mφ、中性粒細胞甚至DC還可吞噬、殺傷、降解入侵病原菌。隨著病原菌被降解，其抗原肽可被專職抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)，如DC和Mφ提呈給T淋巴細胞，進一步激活宿主適應性免疫反應[14]。

天然免疫尤其是天然免疫細胞如何防御病原微生物感染是免疫學甚至生命科學領(lǐng)域的重要課題。本綜述將重點討論在金葡菌感染過程中宿主天然免疫細胞的防御效應，以期闡明金葡菌引起的重癥感染的發(fā)病機理，尋找該類感染性疾病的防治靶標。

1 黏膜免疫屏障

皮膚黏膜、黏液及共生菌群所形成的屏障結(jié)構(gòu)在抵抗外來微生物感染中發(fā)揮重要作用，包括表皮屏障、微生物屏障及化學屏障。黏膜上皮組織構(gòu)成了機體內(nèi)表面的物理屏障，包括上皮層和黏液層。上皮細胞排列緊密，分泌的黏液覆蓋于黏膜表面，阻止金葡菌入侵；呼吸道上皮細胞披覆纖毛，纖毛有規(guī)律的擺動可使黏液向一定方向流動，阻止金葡菌附著，加快其排出[15]。人體的共生菌群是黏膜表面的優(yōu)勢菌群，通過競爭空間及養(yǎng)料產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，營造有利于自身生長而抑制其他病原菌生長的環(huán)境，構(gòu)成微生物屏障[16]。

2 預存的天然免疫分子

參與天然免疫應答的體液因子在0～4 h發(fā)揮作用，是一類反應迅速的效應分子，如抗菌肽、溶菌酶、急性期蛋白、補體和細胞因子等?？咕氖蔷哂锌咕钚缘亩屉?，內(nèi)源性抗菌肽經(jīng)誘導而合成，具有廣譜殺菌作用，高濃度的防御素與組織殺菌素插入細胞壁使其形成孔洞，細菌因細胞壁損傷而死亡[17]。溶菌酶屬低分子量不耐熱堿性蛋白質(zhì)，具有溶菌活性，不僅可直接損傷金葡菌細胞壁的保守成分-肽聚糖(peptidoglycan，PGN)導致金葡菌溶解，還可激活補體和促進吞噬作用[18]。急性期蛋白是機體在應激(如感染)狀態(tài)下發(fā)生變化的一組血清蛋白，可由TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子誘導巨噬細胞產(chǎn)生[19]。其中C反應蛋白可作為調(diào)理素結(jié)合金葡菌表面并活化補體，鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白等可阻止金葡菌的鐵攝取。補體系統(tǒng)可通過甘露糖結(jié)合凝集素途徑或旁路途徑激活，在靶細胞表面產(chǎn)生攻膜復合體并介導細胞溶解。補體激活過程中產(chǎn)生的C3a、C4b和iC3b可固定于細菌表面，通過與吞噬細胞表面CR1、CR3或CR4結(jié)合而促進吞噬細胞的吞噬作用。

3 天然免疫識別

天然免疫細胞表面表達模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)可直接識別病原微生物生存的必要和保守成分-病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule patterns,PAMPs)，產(chǎn)生促炎介質(zhì)，如細胞因子、趨化因子、黏附分子。在金葡菌感染時，Toll樣受體2/6異二聚體(Toll-like receptor 2/6，TLR2/6)、NOD樣受體2(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR2) 和其他受體通過與細菌相應配體，如PGN、細菌脂蛋白和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)等結(jié)合而被激活，導致炎癥細胞因子產(chǎn)生和引起機體平衡失調(diào)[20]。在PGN 刺激下，TLR2 通過募集細胞內(nèi)接頭分子髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)而激活下游多條信號通路，從而誘導下游促炎細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β等促進趨化因子MCP-1和抗炎細胞因子IL-10等產(chǎn)生[20,21]。除被TLR2/6 識別，PGN 也可被巨噬細胞中的溶菌酶消化，消化得到的PGN 保守成分胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)能夠被細胞內(nèi)信號蛋白NOD2 或cryopyrin炎癥體識別而引發(fā)免疫反應。MDP與NOD2結(jié)合后可誘導IL-6、TNF-α和MCP-1表達，而cryopyrin炎癥體發(fā)生寡聚化后促進IL-1β和IL-18成熟[22,23]。

4 天然免疫細胞

天然免疫應答是由多種天然免疫效應細胞參與的早期誘導性應答。參與天然免疫應答的細胞在4～96 h發(fā)揮作用，本文重點討論中性粒細胞、DC、Mφ細胞、肥大細胞、NK細胞、γδ T細胞和固有淋巴樣細胞在抗金葡菌感染中的作用。

4.1中性粒細胞 中性粒細胞約占外周血白細胞總數(shù)的50%～70%，是最早從血液遷移到炎癥部位的吞噬細胞[24]。研究表明，中性粒細胞缺失的小鼠更容易感染金葡菌[25]。慢性肉芽腫病是中性粒細胞功能異常最常見的遺傳性疾病，中性粒細胞表面TLR5、TLR9、CD11b、CD18、CD35和趨化因子受體(C-X-C motif chemokine receptor 1，CXCR1)表達水平降低[26]。TLR5的表達降低導致中性粒細胞無法識別細菌鞭毛；CD11b或CD18低表達導致中性粒細胞吞噬金葡菌的功能受損；CXCR1表達降低導致中性粒細胞無法被趨化于感染部位。

中性粒細胞主要通過吞噬、脫顆粒及形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)3種方式殺滅入侵病原菌[27-29]。金葡菌感染時，中性粒細胞表面的Fc受體和補體受體被激活，增強抗體和補體介導的吞噬作用，吞噬的金葡菌與中性粒細胞內(nèi)的顆粒成分形成吞噬小體的數(shù)目增多[30]。吞噬小體內(nèi)的多種顆粒可降解被吞噬的物質(zhì)，產(chǎn)生多種活性氧基團，包括O2-、H2O2、NO等，作為毒性物質(zhì)直接殺傷細菌?；罨闹行粤＜毎w粒內(nèi)含髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶、溶菌酶、防御素、堿性磷酸酶、還原型輔酶Ⅱ、氧化酶、膠原酶、乳鐵蛋白等多種蛋白，具有直接殺菌或抑制細菌生長及存活的功能。在細胞質(zhì)內(nèi)，鈣網(wǎng)蛋白(S100A8/S100A9)通過隔離膿腫內(nèi)的營養(yǎng)離子Mn2+和Zn2+來抑制細菌生長。NETs是在胞外形成的，主要由DNA、組蛋白、髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶 G、穿透素、明膠酶等組成，染色質(zhì)DNA是構(gòu)成該纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架，顆粒蛋白鑲嵌于其中，可破壞核膜及細胞膜。NETs的作用是一把雙刃劍，適量NETs可捕獲、局限、殺滅病原菌，如金葡菌，當嚴重感染時，如在金葡菌或MRSA感染導致的膿毒癥中，NETs產(chǎn)生過量，對機體造成傷害[31-33]。NETs以組蛋白或髓過氧化物酶依賴的方式損傷血管內(nèi)皮細胞和組織，組蛋白激活TLR2/4-MyD88通路產(chǎn)生更多的促炎因子，引起凝血障礙，誘導血栓形成[34]。在腫瘤微環(huán)境中，中性粒細胞可分為N1型和N2型。最新研究表明，N1型中性粒細胞有助于NETs形成，N2型中性粒細胞在吞噬病原菌后更易被巨噬細胞吞噬清除[35，36]。因此，抑制NETs形成、促進中性粒細胞向N2極化、減少N1 產(chǎn)生是治療金葡菌或MRSA感染導致的重癥感染的有效策略。

4.2DC DC是目前所知的抗原提呈功能最強的專職性抗原提呈細胞(APC)，也是激活初始T細胞、誘發(fā)適應性免疫應答的始動細胞，在免疫識別、免疫應答和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[37,38]。其他APC如Mφ細胞和B細胞等僅能刺激已活化的T細胞或記憶性T細胞。外周組織中未成熟的DC高表達Fc受體、甘露糖受體和TLR等病原體受體，低表達MHCⅡ類分子、共刺激分子和黏附分子，攝取及吞噬病原體的能力較強而抗原提呈能力較弱。未成熟的DC吞噬病原體后從組織遷移到外周淋巴器官，并分化為成熟的DC啟動適應性免疫應答。成熟的DC高表達MHCⅠ和Ⅱ類分子、黏附素和共刺激分子(如CD86、CD80和CD40等)，低表達Fc受體和模式識別受體，因此抗原提呈能力較強而抗原攝取能力較弱。朗格漢斯細胞是位于表皮和胃腸道上皮部位的未成熟DC，在金葡菌導致的皮膚感染中，朗格漢斯細胞能夠吞噬金葡菌并發(fā)揮抗原加工和提呈等作用[39]。

作為特異性免疫應答的始動者，DC在感染早期可分泌大量細胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-12等參與機體免疫調(diào)節(jié)[38]。IL-12是天然免疫反應中最重要的細胞因子之一，DC通過分泌IL-12促進 CD4+T 輔助細胞的增殖和分化，從而誘導Th1型免疫反應。研究表明，CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠由于DC缺失，導致IL-12分泌受阻。與野生型小鼠相比，CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠金葡菌感染引起的炎癥損傷更為嚴重、死亡率更高，通過將未成熟或成熟DC回輸?shù)秸ALB/c小鼠體內(nèi)，小鼠清除肺部金葡菌能力增強。當腹腔注射外源性IL-12后，DC缺失的小鼠抗金葡菌感染的免疫功能恢復[40]。表明DC可能通過產(chǎn)生IL-12調(diào)節(jié)天然免疫和適應性免疫反應，抵抗金葡菌感染。CD40L是由活化的血小板分泌的趨化因子，具有促進DC吞噬MRSA和成熟等功能[41]。

4.3Mφ細胞 Mφ細胞是專職性APC，具有強大的吞噬功能，廣泛分布于各組織中，其形態(tài)和功能由所處的組織部位決定。最新研究發(fā)現(xiàn)組織定居Mφ細胞最初起源于胚胎中的卵黃囊[42]。在穩(wěn)態(tài)條件下，定居于肺泡、腦、肝臟和表皮等組織的Mφ細胞能夠自我更新而不需要循環(huán)中單核細胞的補給；在炎癥條件下，血液循環(huán)中的單核細胞被招募進入組織，并分化為具有組織特異性功能的Mφ細胞，稱為招募的Mφ或炎癥Mφ細胞[43]。Mφ細胞能夠識別、吞噬并清除侵入機體的病原體，并將抗原提呈給周圍和淋巴器官的T細胞，誘發(fā)適應性免疫應答。

Mφ細胞在金葡菌感染中發(fā)揮重要的免疫防御作用。在小鼠流感病毒感染后的肺炎模型中，通過GM-CSF介導的肺泡Mφ細胞大量涌入有利于機體抵抗繼發(fā)的金葡菌感染，其機制主要通過增加肺泡Mφ細胞產(chǎn)生的活性氧實現(xiàn)[44]。金葡菌細胞壁的成分PGN或LTA刺激Mφ細胞產(chǎn)生IL-33[45]。IL-33通過促進中性粒細胞的增殖、募集吞噬并殺傷金葡菌[46]。此外，IL-33通過與其受體ST2結(jié)合從而激活Akt-catenin通路促進NO釋放殺菌[47]。金葡菌細胞壁成分脂蛋白也能夠通過激活巨噬細胞TLR2受體增加NO分泌，早期NO的釋放能夠有效地保護機體免于金葡菌感染[48]。TNF-α和IL-6是前炎癥因子的典型代表，前期的炎癥反應有利于機體控制感染的擴散。在TLR2被阻斷的小鼠原代腹腔巨噬細胞中，金葡菌誘導TNF-α、IL-6和IFN-γ產(chǎn)生受阻[49]。

Mφ細胞具有強的可塑性，在體外不同的微環(huán)境下可分化為M1型和M2型[50]。M1型又稱經(jīng)典活化的Mφ細胞，分泌TNF-α、IL-1、IL-12和NO等促炎癥細胞因子，具有較強的抗原提呈和殺菌能力，在炎癥早期發(fā)揮主要作用，但大量炎癥因子的產(chǎn)生也會引發(fā)“細胞因子風暴”，損壞機體正常組織；M2型被稱為替代活化的Mφ細胞，分泌IL-10和TGF-β等抑炎性細胞因子,參與組織修復和傷口愈合，在炎癥恢復階段發(fā)揮重要作用[51]。因此，在金葡菌或MRSA感染導致的膿毒癥早期，促進M1向M2轉(zhuǎn)化，對膿毒癥小鼠具有保護作用[52]。

4.4肥大細胞 肥大細胞是皮膚和黏膜的重要哨兵細胞，主要參與IgE介導的超敏反應，同時也參與宿主抗感染免疫應答。當機體被細菌感染時，肥大細胞可通過胞吞作用直接殺滅入侵的病原體，還能通過直接識別病原微生物及其產(chǎn)物參與機體防御反應。肥大細胞最大的特點是能夠在胞漿中儲存大量TNF-α，因此TNF-α的快速釋放是肥大細胞激活的標志。金葡菌感染機體后，肥大細胞通過脫顆粒釋放TNF-α，并通過上調(diào)血管細胞間黏附分子1和E選擇素募集中性粒細胞和DC，前者能夠直接殺傷金葡菌，后者在啟動適應性免疫應答中發(fā)揮重要作用[53,54]。

4.5NK細胞 NK細胞通過與Mφ細胞或中性粒細胞的相互作用參與機體抗金葡菌感染的天然免疫。研究表明，NK細胞與肺泡Mφ細胞的相互作用有利于Mφ細胞對金葡菌的吞噬及清除[55]。金葡菌感染時，NK細胞分泌的IL-22和IL-17等細胞因子有利于機體控制感染。IL-22是IL-10家族成員之一，主要由T細胞產(chǎn)生，也可由NK細胞和固有淋巴樣細胞產(chǎn)生。IL-22可誘導皮膚炎癥部位產(chǎn)生能夠抑制金葡菌生長的抗菌蛋白如S100A7和CAP18/LL37[56]。同時，IL-22還可通過活化STAT3信號通路，促進具有抑制金葡菌增殖功能的蛋白SLURP1表達[57]。IL-17主要由T細胞分泌，也可由NK細胞、γδ T細胞和固有淋巴樣細胞等分泌，在金葡菌感染時IL-17也能募集中性粒細胞到達炎癥部位[58]。

4.6γδ T細胞 γδ T細胞作為參與天然免疫的T細胞群體，占外周血成熟T細胞的5%～10%，主要分布于黏膜和皮下組織，具有免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)等功能，是聯(lián)系天然免疫和適應性免疫的橋梁。盡管γδ T細胞僅占天然免疫細胞中的小部分，但其在抗金葡菌感染過程中的作用不容忽視。最新的研究進一步證實Vγ6+Vδ4+T細胞是金葡菌感染過程中具有免疫保護作用的主要γδ T細胞亞群[59]。在金葡菌皮膚感染小鼠模型中，感染部位有大量γδ T細胞聚集[60,61]。γδ T細胞通過產(chǎn)生大量IL-17，誘導中性粒細胞的募集和促炎癥細胞因子如IL-1和TNF的釋放[58]。與野生型小鼠相比，γδ T細胞缺失的金葡菌感染的小鼠中性粒細胞募集受到抑制，局部組織損傷更為嚴重，細菌荷載量更高[62]。

4.7ILC ILC是來源于共同淋巴祖細胞、具有天然免疫細胞特征的淋巴細胞。ILC可分為3個亞類：ILC1、ILC2 和ILC3。ILC1和ILC2主要分布于肝臟和腸道等部位，在抗病毒、胞內(nèi)菌和寄生蟲感染過程中發(fā)揮重要作用[63]。ILC3主要分布于扁桃體及腸道固有層，在抗細菌感染中發(fā)揮重要作用，可分泌IL-22和IL-17等細胞因子[64]。提示ILC3可能通過作用于中性粒細胞發(fā)揮抗金葡菌感染作用。

5 總結(jié)與展望

機體的物理、化學屏障和天然免疫系統(tǒng)共同組成抵抗外來病原菌入侵的第一道防線。病原菌與宿主在免疫細胞水平的相互作用是其致病的重要環(huán)節(jié)。在金葡菌感染過程中，天然免疫細胞在病原菌的吞噬、識別及清除過程中起關(guān)鍵作用。天然免疫細胞通過PRRs對金葡菌的PAMPs進行識別，進而激活相關(guān)信號通路，產(chǎn)生多種細胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-22和IL-33等)和趨化因子(如MCP-1、MIP-2等)，招募、激活、趨化多種免疫效應細胞，如中性粒細胞、Mφ細胞和DC等誘導天然免疫應答。同時，吞噬了金葡菌的DC遷移至淋巴結(jié)并啟動適應性免疫反應。此外，在抗感染過程中，Mφ細胞發(fā)揮抗原提呈作用。宿主對病原體的成功防御是快速的天然免疫反應及適應性免疫反應的共同結(jié)果。

宿主在抵抗病原菌入侵過程中產(chǎn)生大量促炎癥細胞因子，適當?shù)募毎蜃雍铣珊头置趯τ谒拗鞯拿庖叻烙鶃碚f是必要的，但是過度的炎癥反應會導致SIRS，甚至引起多器官功能障礙，最終導致死亡。HDT旨在減少感染過程中過度的炎癥反應，在病灶部位平衡機體的免疫反應，從而對機體起保護作用。近年中藥及其有效成分在抗金葡菌感染方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，如中藥麻黃的有效成分-鹽酸麻黃堿(ephedrine hydrochloride，EH)具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。在金葡菌感染導致的急性腹膜炎小鼠模型中，EH通過促進抗炎因子IL-10分泌和抑制促炎因子TNF-α的表達，減輕肝臟和腎臟病理損傷，提高小鼠存活率[21,65]。臺灣含笑的倍半萜內(nèi)酯類化合物-含笑內(nèi)酯(micheliolide，MCL)可下調(diào)MRSA感染小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1和IFN-γ等炎癥因子分泌，減輕肝、腎組織病理損傷，降低小鼠死亡率[66]。因此，從HDT角度出發(fā)，調(diào)控宿主的免疫反應，為抗金葡菌可甚至是耐藥菌感染提供新思路。