橡膠樹莖干褐斑病病原鑒定及室內防治藥劑篩選

蔣桂芝，李 麗，劉一賢，周 明*

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪666100；2.勐滿農場管委會農林水服務中心，云南勐臘666309）

云南植膠區(qū)由于特殊的氣候環(huán)境，橡膠樹病害種類較多，隨著種植時間延續(xù)，一些新病害在不斷發(fā)生，并逐漸顯現(xiàn)出經(jīng)濟上的重要性。上世紀90 年代，云南植膠區(qū)持續(xù)發(fā)生橡膠樹小蠹蟲（Bark beetle）為害［1］；2003-2004 年，西雙版納持續(xù)橡膠樹盔蚧（Parasaissetia nigraNitner）大發(fā)生［2］；2005 年，在云南河口發(fā)生橡膠樹棒孢霉落葉病[Corynespora cassiicola（Berk. & Curt.）Wei]［3］；2012-2013 年，在云南景洪發(fā)生鐮刀菌（Fusariumsp.）侵染引起橡膠樹的莖基腐病和莖干潰瘍?。?］，等等。這些病蟲害的發(fā)生都給生產(chǎn)帶來不同程度的損失。

2014 年4 月，筆者在對云南省主要橡膠種植區(qū)進行病害普查的過程中，在景洪市勐養(yǎng)農場發(fā)現(xiàn)一種橡膠樹莖干褐斑病，造成橡膠樹莖干樹皮潰瘍，癥狀表現(xiàn)為：在感病部位表面有少量點狀棕褐色分泌物，分泌物干后呈淺茶色印跡或黑色點狀，樹皮表層粗皮沒有變色壞死現(xiàn)象，感病嚴重的橡膠樹產(chǎn)量大幅下降，同時可引起小蠹蟲為害導致橡膠樹死亡。此次發(fā)現(xiàn)的褐斑病與已知的由疫霉菌（Phytophthorasp.）［6］、鐮刀菌（Fusariumsp.）［6-7］引起的橡膠樹莖干潰瘍有明顯的差異。為找到相應的防治措施，筆者對勐養(yǎng)的感病病株進行了采樣和病原分離，依據(jù)形態(tài)、致病性、分子生物學對病原菌進行鑒定，并作病原菌適宜生長溫度及防治藥劑篩選測試，為進一步開展防治技術研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病樣及植株：于2014 年4 月在云南省景洪市勐養(yǎng)農場銀河生產(chǎn)隊感病橡膠樹采集罹病樣品35 株，其 中GT1 品種13 株，PR107 品種12 株，RRIM600 品種10 株。用刀刮除病斑及病健交界處樹皮的表層粗皮，然后用滅菌手術刀切取大小為0.3～0.5 cm×0.3～0.5 cm 病健交界處樹皮組織，放到無菌的塑料小瓶中作為病原菌的分離材料，帶回實驗室。分別選用種植3 年的云研77-2幼樹和種植14 年的正常橡膠樹（林下株）莖干為接種材料。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉17 g、水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 褐斑潰瘍病病原菌的分離及鑒定

病原菌的分離及形態(tài)鑒定：將采集的樣本放在直徑5 cm 的培養(yǎng)皿中用75%酒精消毒30 s，涼干后在培養(yǎng)皿中加入0.1%的升汞液，使樣品完全浸在升汞液中消毒處理1 min，隨后將消毒處理過的樣本放到滅菌水中清洗1 min，重復清洗3 次，然后用滅菌濾紙吸取樣本外多余的水分，將處理好的樣本放置在PDA 培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5～7 d 后PDA 平板上有菌落形成。將所得菌落孢子依據(jù)方仲達（1990）［8］方法進行單孢分離，依據(jù)Hirooka［9］和莊文穎［10］的文獻進行形態(tài)學鑒定。在PDA 平板上繼代培養(yǎng)得到純培養(yǎng)菌株，用于致病性試驗。

ITS 序列比較和系統(tǒng)發(fā)育樹分析：依據(jù)DNA快速抽提試劑盒說明書提取菌絲體中的DNA，利用ITS1/ITS4 引物對其進行擴增和測序［11］。rDNA ITS 區(qū)序列擴增及分析采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′），擴增該病原菌5.8 S rDNA 及其兩邊的ITS1 和ITS2 基因片段。擴增反應體系50 μL：真菌DNA 模 板0.5～1.0 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μ mol/L ITS4 1 μ L、2× Master Mix25 μ L、ddH2O 10 μL，加水補至50 μL。 PCR 擴增程序：預變性94℃5 min；變性94℃30 s，50℃45 s，72℃45 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR 擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收，純化后的PCR 產(chǎn)物克隆至pGEM-T-Easy 載體，并委托生工生物工程（上海）有限公司完成測序。將該病原菌的ITS 序列與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)庫中有關序列進行同源性比較，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中篩選已公布的叢赤殼菌株ITS 序 列，采 用 軟 件Mega 7.0 中 的NJ（Neighbor-Joining）法對選中的ITS 序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定其分類地位。

1.2.2 分離物致病性的測定試驗及再分離

因橡膠開割樹與幼樹的樹皮厚度、結構差異較大，在感病癥狀和時間上會表現(xiàn)不一致，同時考慮到材料的來源，先進行橡膠幼樹致病性測定試驗，感病后再作橡膠割膠樹致病測定試驗。

測試病原菌在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，用滅菌打孔器將菌落打成直徑5 mm 菌絲塊備用。

（1）橡膠幼樹致病性測定試驗：在橡膠幼樹莖干距地面1.0 m 左右的高處用直徑5 mm 的打孔器打深度為2 mm 的孔，用滅菌濾紙吸去小孔中滲出的膠乳，然后在小孔中接種備好的測試菌絲塊，對照接種直徑5 mm 的PDA 瓊脂塊，隨后用保鮮塑料薄膜包裹保濕。第3 天除去包裹塑料薄膜，開始觀察接種點樹皮組織的變化，以后每隔2 d 觀察1 次，當樹皮組織出現(xiàn)壞死變褐感病癥狀后再進行病原菌分離，得到與接種一致的菌落時確認為病原菌。

腿腳不便的老人出趟門也不容易。城鄉(xiāng)地區(qū)無障礙建設還比較滯后，中國消協(xié)與中國殘聯(lián)去年的一項百城調查顯示，我國無障礙設施實地體驗調查普及率為40.6%，大眾感知調查普及率僅為37%。一些行動困難的老人上公廁找不著扶手、坐公交艱難登臺階、下地鐵沒法坐輪椅、老弱病殘孕專座被擠占等麻煩還有很多。

（2）橡膠割膠樹致病性測定試驗：在割膠樹莖干按同樣方法（打孔深度5 mm）接種。第7 天除去包裹薄膜開始觀察，以后每隔7 d 觀察1 次，當樹皮組織出現(xiàn)與田間感病癥狀一致，再進行病原菌分離，得到與接種一致的菌落時確認為病原菌。

1.2.3 病原菌適宜溫度的測定

將病原菌擴繁后用滅菌的打孔器打成直徑5 mm 的菌絲塊，分別接種在PDA 平板上，置于5、10、15、20、25、30、35、40℃溫度和80%RH 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后取出，用數(shù)顯卡尺測量菌落生長直徑，依據(jù)各處理菌落生長情況確定病原菌的適宜溫度。

1.2.4 防治藥劑的篩選試驗

根據(jù)農藥對病原菌的不同作用機理，選取11種農藥開展試驗，依據(jù)各農藥的推薦使用濃度選中間值計算配制各試驗農藥的濃度，然后將其配制成含毒培養(yǎng)基。50%異菌脲可濕性粉劑、50%多菌靈可濕性粉劑、50%腐霉利可濕性粉劑、72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑、40%多·?！や寰婵蓾裥苑蹌?、40%嘧菌酯懸浮劑、30%苯甲·丙環(huán)唑乳油、240 g/L 噻呋酰胺懸浮劑、20%吡唑醚菌酯懸浮劑、240 g/L 戊唑醇懸浮劑、20%噻菌銅懸浮劑等農藥制成含毒培養(yǎng)基的有效成分含量分別為0.5、0.5、0.5、0.72、0.2、0.2、0.3、2.4、0.1、2.4、0.16 mg/L。取250 mL 的三角瓶，分別在每個瓶中裝入100 mL 的PDA 培養(yǎng)基，滅菌備用；各種農藥按有效成分分別配制成母液，用移液槍將各種農藥按比例分別加入裝有PDA 培養(yǎng)基的三角瓶中搖勻，制成含毒培養(yǎng)基平板，編號備用。將擴繁好的病原菌平板用滅菌打孔器打成直徑5 mm 的菌絲塊，分別接種到各農藥的含毒培養(yǎng)基上，對照接PDA 平板，在25℃條件、80%RH 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察、記錄菌落的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 和SPSS 21 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，以Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及形態(tài)鑒定

經(jīng)過培養(yǎng)、分離得到一種菌落，通過多次稀釋、單孢分離、萌發(fā)培養(yǎng)得到純化菌株，編號XJ140417。在PDA 培養(yǎng)基上，菌落產(chǎn)淺紅色色素（圖1-a）；孢子梗不分枝，直立，近圓柱形，頂部漸尖（圖1-b）；培養(yǎng)15 d 后，在菌落表面產(chǎn)生疣狀物，散生或聚生，表生，為產(chǎn)孢的束絲，新鮮時為橘紅色或橙黃色（圖1-c）；分生孢子卵形、橢圓形、長橢圓形，無隔，表面平滑，無色，4.1 ～6.1 μm×2.3 ～3.8 μm（圖1-d）。根據(jù)形態(tài)特征，鑒定為叢赤殼科叢赤殼屬假毛叢赤殼菌（Nectria pseudotrichia）。

ITS 序列比較和系統(tǒng)發(fā)育樹分析：病原菌DNA利用ITS1/ITS4 引物進行PCR 擴增，獲得555 bp ITS序列（登錄號為KX869739），XJ140417 的ITS 序列和已公布的叢赤殼菌序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）結果表明，XJ140417 與假毛叢赤殼菌（Nectriapseudotrichia）

圖1 PDA培養(yǎng)的的菌落形態(tài)、分生孢子梗、束絲及分生孢子

聚為一支，與叢 赤 殼 菌HM48455.4、

KU940138.1 的ITS 序列同源性均為99% ，分子鑒定病原菌為（N. pseudotrichia）。

形態(tài)學鑒定和分子鑒定相一致，確定病原菌為N.pseudotrichia。

2.2 分離物的致病性及發(fā)病植株再分離

幼樹接種試驗：接種10 d 后，發(fā)現(xiàn)幼樹接種點樹皮發(fā)生褐色病變，癥狀與田間相似（圖3-a），對照不感?。▓D3-b）。從發(fā)病部位重新分離獲得病原物，其培養(yǎng)性狀和分生孢子形態(tài)與接種菌一致，表明菌株為該病的致病菌。

割膠樹致病測試：接種5 d 后除去包裹薄膜，接種30 d 形成的病斑較小，持續(xù)觀察，接種60 d后出現(xiàn)的感病癥狀與田間完全一致（圖3-c）；對照不感病，傷口愈合（圖3-d）。從發(fā)病部位重新分離獲得病原物，其培養(yǎng)性狀和分生孢子形態(tài)與最初分離物一致，表明菌株為該病的致病菌。

圖2222 基于ITS序列病原菌XJ140417和近源物種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 溫度對病原菌菌絲生長量的影響

在不同溫度下5 d 菌絲生長結果：當溫度為20℃時，菌絲生長量達到最大，為61.3 mm；當溫度為25、30、15℃時，菌絲生長量分別為47.7、45.0和20.0 mm；在5℃和35℃時，菌絲生長停止。表明該菌最適生長溫度為20℃，適宜生長溫度為15～30℃，生長范圍為5～35℃（圖4）。

2.4 防治藥劑的篩選

圖3 幼樹（a和b）和割膠樹（c和d）接種后的癥狀

圖4 溫度對病原菌菌絲生長量的影響

試驗結果（表1）表明：在P＜0.01 水平上，參試11 種藥劑藥效差異達極顯著，其中50%多菌靈、50%多·?！や寰?、30%苯甲·丙環(huán)唑、240 g/L戊唑醇等4 種藥劑效果最好，菌絲生長分別為0.00、0.00、0.30 和0.15 cm，可以完全控制病原菌菌絲的生長，50%異菌脲、50%腐霉利、72%霜脲·錳鋅L、40%嘧菌酯、20%吡唑醚菌酯的效果依次遞 減，菌 絲 生 長 分 別 為0.85、2.30、4.98、5.13 和5.55 cm，240 g/L 噻呋酰胺和20%噻菌銅的效果最差，菌絲生長分別為8.10 和8.60 cm，且噻菌銅對病原菌菌絲的生長似乎有促進作用。田間防治推薦選用50%多菌靈、50%多·?！や寰?、30%苯甲·丙環(huán)唑、240 g/L 戊唑醇。

表1 不同藥劑對病原菌菌絲生長的影響

3 討論

云南勐養(yǎng)農場膠園出現(xiàn)的莖干褐斑病主要危害橡膠樹主干，早期在感病部位表面有少量點狀棕褐色分泌物。筆者從現(xiàn)場采集到茶褐色液體狀分泌物樣品帶回實驗室鏡檢，在分泌物中含有大量的分生孢子，經(jīng)在PDA 平板上培養(yǎng)，7 d 后形成的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)與病斑分離得到的病原菌一致，為假毛叢赤殼菌（N. pseudotrichia）；病原菌在PDA 平板上培養(yǎng)15 d 后產(chǎn)生產(chǎn)孢的束絲，束絲有吐水現(xiàn)象，這種現(xiàn)象或許是橡膠樹病斑上有分泌物形成的原因。

由假毛叢赤殼菌引起的橡膠樹莖干褐斑病在橡膠上是首次報道。國內外有關假毛叢赤殼菌引起植物病害的報道并不多。國外報道其在巴西和澳大利亞分別引起梨潰瘍?。?2］和澳洲堅果潰瘍病［13］。試驗表明，該病原菌菌絲生長最適溫度為15～30℃，適宜生長范圍為10～35℃，與云南熱帶和亞熱帶地區(qū)的氣候特點［14］相吻合。假毛叢赤殼菌的無性和有性階段廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，是雙子葉植物常見的病原真菌之一［15］。云南橡膠種植區(qū)為熱帶和亞熱帶地區(qū)，褐斑病的病原菌假毛叢赤殼菌的來源區(qū)域與資料記載相符。因而，該病害的發(fā)生不是偶然的，是外來物種橡膠樹適宜云南熱帶和亞熱帶地區(qū)環(huán)境條件的同時，該病原菌也逐漸適應橡膠樹的結果。

對橡膠樹褐斑病的觀察發(fā)現(xiàn)，褐斑病病斑周年都在擴展，在每年的10 月至翌年的3 月擴展速度大于4-9 月，這可能與橡膠種植區(qū)每年的10 月至翌年3 月的溫度相對較低（一般日溫度范圍在15～30℃較多），4-9 月的溫度相對較高（一般日溫度范圍在21～37℃較多）有關，也與病原菌假毛叢赤殼菌的適宜生長溫度試驗結果相吻合。

根據(jù)目前研究的結果來看，橡膠樹褐斑病將來有可能成為云南橡膠樹的主要莖干病害。感病嚴重的橡膠樹后期易受小蠹蟲、天牛等鉆柱性害蟲為害，形成次生蟲害，降低抗風性的同時也縮短了橡膠樹的經(jīng)濟壽命。因此，對該病害的防治應重在預防和早期治療。假毛叢赤殼菌對橡膠樹的致病機理目前尚不清楚，還需深入研究，才能找到有效的預防和早期治療措施。