金毛狗脊內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定及其拮抗作用分析

陳澤歷 楊林毅 陳 潞 飛進(jìn)強(qiáng) 柯尚艷 郭建志 文國(guó)松 趙明富,3

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性控制病蟲害教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)功能產(chǎn)品研究中心，云南 昆明 650201；4. 云南恩潤(rùn)生物科技發(fā)展有限公司，云南 普洱 665000)

植物內(nèi)生細(xì)菌可與寄主建立和諧共生關(guān)系的一類定殖在植物組織和器官內(nèi)的微生物，不影響宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育。內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫(kù)[1]，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)并對(duì)植物病害產(chǎn)生防御反應(yīng)，有利于植物生態(tài)系統(tǒng)的平衡。近年來(lái)有關(guān)藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定以及篩選出具有抑菌活性的菌株的報(bào)道較多。饒小莉等從甘草（Glycyrrhiza uralensis）中分離篩選出拮抗小麥根腐病菌和棉花立枯病菌等8 種植物病原菌的內(nèi)生細(xì)菌菌株，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）， 多 黏 類 芽 孢 桿 菌（Paenibacillus polymyxa）等[2]。冀玉良等從連翹（Forsythia suspensa）植株中分離到的42 株細(xì)菌，7 株具有較高的抑菌活性，基本抑制了植物病原菌的繁殖與菌絲生長(zhǎng)[3]。中草藥透骨草（Phryma leptostachya）的植株中也含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌，其中一株內(nèi)生枯草芽孢桿菌對(duì)植物灰霉病菌有較強(qiáng)且穩(wěn)定的拮抗作用，其抑菌帶可以達(dá)到11 mm[4]。寧夏枸杞（Lycium barbarum）中的內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性豐富，抑菌試驗(yàn)測(cè)定的34 株內(nèi)生細(xì)菌中，有76.5%的測(cè)定菌對(duì)一種或多種病原菌的生長(zhǎng)有抑制作用[5]。還有報(bào)道稱內(nèi)生細(xì)菌對(duì)自身寄主植物病原菌具有拮抗作用，人參菌核病是人參最嚴(yán)重的土傳病害之一，人參根部中分離得到的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）抑制人參菌核病菌（Sclerotinia ginseng）的菌絲生長(zhǎng)和菌核萌發(fā)[6]。上述研究結(jié)果表明，藥用植物體內(nèi)的內(nèi)生菌可作為生物農(nóng)藥開發(fā)的原料。

金毛狗脊（Cibotium barometz）為蚌殼蕨科（Dicksoniaceae）金毛狗屬植物，其干燥根莖作為中藥狗脊入藥，味苦、甘，溫，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝等功效，用于腰膝酸軟，風(fēng)濕痹痛，下肢無(wú)力等癥[7]。金毛狗脊不僅是珍稀的藥用植物還可作為園林觀賞植物，隨著市場(chǎng)需求量的增加，野生資源匱乏，其生長(zhǎng)的環(huán)境和生態(tài)受到嚴(yán)重破壞。研究金毛狗脊的內(nèi)生菌，有利于探究?jī)?nèi)生菌與宿主金毛狗脊的關(guān)系，也為獲得拮抗病原菌的菌株提供資源。文獻(xiàn)中關(guān)于藥用植物金毛狗脊內(nèi)生菌的研究很少，僅樊有賦等從金毛狗脊植物的根、莖、葉中分離到14 株內(nèi)生真菌，分屬于3 綱4 目5 科7 屬，多數(shù)屬于半知菌，擬青霉屬和擬盤多毛孢屬為優(yōu)勢(shì)屬，分別占總株數(shù)的28.57%和21.42%[8]，但內(nèi)生細(xì)菌的研究未見報(bào)道。滇黃精（Polygonatum kingianum）是中藥黃精的基源植物之一，以根狀莖入藥，隨著滇黃精種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，病害發(fā)生較嚴(yán)重，影響藥材質(zhì)量和產(chǎn)量，而從植物體內(nèi)篩選的內(nèi)生細(xì)菌有望作為防治病害的生物防治因子，可提高藥材品質(zhì)。本研究從金毛狗脊上分離得到內(nèi)生細(xì)菌菌株，對(duì)其進(jìn)行拮抗滇黃精膠孢炭疽菌和腐皮鐮刀菌的室內(nèi)抑菌試驗(yàn)，篩選出抑制效果最顯著的菌株進(jìn)行鑒定，明確其分類地位，從而建立資源庫(kù)為后期研究生防菌、開發(fā)合成微生物菌肥提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及供試病原菌

2017 年8 月采自于云南普洱的金毛狗脊（移栽于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山大棚）。2 種滇黃精病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和腐皮鐮刀菌（Fusariumsolani）菌株；生理生化參考菌株1、2、3 分別為簡(jiǎn)單芽孢桿菌（Bacillus simplex），巨大芽孢桿菌（Bacillius megaterium），蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基用于膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌活化及對(duì)峙實(shí)驗(yàn)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基用于待測(cè)菌株的分離與活化；生理生化培養(yǎng)基（糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基，耐鹽性培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，吲哚培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，卵磷脂酶培養(yǎng)基，Tween 80 培養(yǎng)基，L-苯丙氨酸培養(yǎng)基，檸檬酸鹽培養(yǎng)基）的配制參照文獻(xiàn)[9]。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離

依據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行分離，在超凈工作臺(tái)上，將健康的金毛狗脊塊莖用75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3 次，再置于1%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗4 次，放在無(wú)菌濾紙上吸干水分。刮去塊莖的表皮，放于無(wú)菌研缽中進(jìn)行研磨。稱取10 g 處理后的樣品放入盛有90 mL 無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用手或置搖床振蕩10 min，使樣品和水充分混合，然后于30 ℃恒溫培養(yǎng)1 周，即成10-1稀釋液；再用移液槍吸取10-1稀釋液1 mL（此操作需在超凈工作臺(tái)進(jìn)行），移入另一盛有9 mL 無(wú)菌水的試管中，混合均勻，依此類推，連續(xù)稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5一系列稀釋度的稀釋液，用移液槍吸取100 μL 稀釋液，用涂布器在NA 培養(yǎng)基上均勻涂布（平板涂布法），每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并挑取單菌落分離純化，將純化后的菌株，-80 ℃長(zhǎng)期保存。

1.4 菌株生理生化特性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行糖、醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，耐鹽性實(shí)驗(yàn)，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)，接觸酶反應(yīng)，淀粉水解反應(yīng)等12 項(xiàng)生理生化特性研究，具體方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.5 16S rDNA 序列測(cè)定與分析

1.5.1 DNA 的提取

本實(shí)驗(yàn)采用CTAB/NaCl 法提取JMGJ01 菌株基因組DNA。將菌株以100∶1 的比例接種到PDA 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)10 h 左右，可過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液吸取1 mL 于1.5 mL 無(wú)菌離心管中，以12000 r/min 離心10 min（若離心后量不夠可重復(fù)此步驟）。棄上清液，加入100 μL 1×TE 液后充分混勻，靜置1 min，10000 r/min 離心洗滌1 min。棄上清液，加入1.84 μL 10% SDS 和350 μL 1×TE 液，沸水煮10 min。向管中加入7.4 μL的5 mol/L NaCl，再加入5.12 μL CTAB/NaCl 混勻，后在其65 ℃水浴鍋加熱10 min。再加入24∶1氯仿/異戊醇358.8 μL，搖勻后以12000 r/min 離心10 min。取上清液到新的離心管中，加入24∶1氯仿/異戊醇358.8 μL，搖勻后以12000 r/min 離心10 min。再取上清液到新的離心管中，加入0.6 倍體積的冷異戊醇，混勻后放在-20 ℃冰箱里，至少1 h。之后再以12000 r/min 離心10 min，棄上清液，用70%乙醇清洗2～3 次得菌株的DNA。最后再加入100 μL TE 溶解DNA，即為總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR 擴(kuò)增

采用通用引物 27F/1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[10]。反應(yīng)體系總體積為50 μL：2×PowerTaqPCR masterMix 25 μL，上游引物（27F）1 μL，下游引物（1492R）1 μL，總DNA 15 μL，ddH2O 8 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；56 ℃30 s；72 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。電泳采用瓊脂糖凝膠電泳，以花青素作為核酸染料，觀察Marker 大小。將擴(kuò)增得到的PCR 純化產(chǎn)物送出進(jìn)行測(cè)序（上海生物工程有限公司），所得序列結(jié)果與NCBI GeneBank 中已發(fā)表的基因進(jìn)行比對(duì)。

1.6 JMGJ01 菌株的拮抗實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用平板對(duì)峙法[11]。將從滇黃精上分離到的膠孢炭疽菌菌株和腐皮鐮刀菌菌株于28 ℃溫箱里進(jìn)行活化；將濾紙打成小圓片，且進(jìn)行滅菌。后在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行操作，將濾紙放入PDA 平板上，使其成等邊三角形或正四邊形，將其分成2 份，在等邊三角形或正四邊形中間接上病原菌，濾紙片上接種過(guò)夜培養(yǎng)的JMGJ01 菌株10 μL，以加滅菌水為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，并于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d。測(cè)定個(gè)處理菌落直徑，計(jì)算出抑菌率（%）[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及菌株JMGJ01 生理生化特性

從藥用植物金毛狗脊塊莖中分離到31 株內(nèi)生細(xì)菌，表明金毛狗脊塊莖中具有豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源。將其中1 株菌株JMGJ01 和3 株參考菌株進(jìn)行以下12 項(xiàng)生理生化特性試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1 可知：JMGJ01 菌株不具耐鹽性；均能在D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和甘露醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；不能利用檸檬酸鹽；明膠試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)；可使淀粉水解，菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈，為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；甲基紅試驗(yàn)、V-P 反應(yīng)、酯酶Tween-80 試驗(yàn)均呈陽(yáng)性；吲哚乙酸試驗(yàn)、接觸酶、卵磷脂酶和L-苯丙氨酸酶反應(yīng)均為陰性。通過(guò)觀察試驗(yàn)菌株與各物質(zhì)的特異性反應(yīng)可初步鑒定內(nèi)生細(xì)菌JMGJ01 菌株屬類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

表 1 JMGJ01 菌株和參考菌株生理生化特性測(cè)定結(jié)果Table 1 Bacillus JMGJ01 strain and reference strains measurements of physiological and biochemical characteristics

2.2 菌株JMGJ01 16S rDNA 基因鑒定結(jié)果

JMGJ01 測(cè)序得1255 bp 的16S rDNA，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已發(fā)表的基因進(jìn)行同源性比較（表2），結(jié)果表明：JMGJ01 菌株與Paenibacillus的同源性為96%。結(jié)合生理生化及16S rDNA序列同源性比較的結(jié)果，JMGJ01 鑒定為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的1 種細(xì)菌。

表 2 JMGJ01 菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已發(fā)表基因?qū)Ρ冉Y(jié)果Table 2 JMGJ01 strains sequencing results compared with published in GenBank gene

2.3 菌株JMGJ01 的拮抗實(shí)驗(yàn)

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法在溫箱里28 ℃對(duì)峙培養(yǎng)4 d 后菌株JMGJ01 對(duì)炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和鐮刀病菌（Fusarium solani）都有不同的抑制作用，抑菌率分別為65.11%和73.72%（圖1）。

圖 1 JMGJ01 菌株對(duì)膠孢炭疽病菌（左圖）和腐皮鐮刀菌（右圖）菌株的拮抗作用Fig. 1 The strains JMGJ01 exhibited antagonistic effect against Colletotrichum gloeosporioides (left) and Fusarium solani (right)

3 結(jié)論與討論

本研究從金毛狗脊上分離得到31 株內(nèi)生細(xì)菌，篩選出一株對(duì)炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和鐮刀病菌（Fusarium solani）有明顯的拮抗作用的菌株JMGJ01。菌株JMGJ01結(jié)合參考菌株1、參考菌株2、參考菌株3 進(jìn)行生理生化測(cè)定，并通過(guò)16SrDNA 序列分析，結(jié)果表明菌株JMGJ01 屬于芽孢桿菌目類芽孢桿菌科類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），為非芽孢桿菌科的芽孢桿菌。

在植物體內(nèi)內(nèi)生菌與病原菌相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、空間，使病原菌不能正常繁殖而消亡，因此內(nèi)生菌可對(duì)宿主植物產(chǎn)生防病效應(yīng)。類芽孢桿菌可促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，對(duì)真菌、細(xì)菌病原體及線蟲病害都有拮抗作用[13]。金玉等[14]從藥用植物短柄龍膽（Gentiana stipitata）中分離到一株內(nèi)生類芽孢桿菌WZ-6（Paenibacillus terrae），WZ-6 對(duì)黃瓜褐斑病菌有明顯抑制作用。1 株大豆內(nèi)生多粘類芽孢桿菌對(duì)引起大豆主要病害的大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑均達(dá)到 20 mm 以上[15]。本研究中分離到的內(nèi)生類芽孢桿菌JNGJ01 對(duì)測(cè)試的2 種病原菌有明顯的拮抗作用，抑菌率分別為65.11%和73.72%，抑菌效果較好。類芽孢桿菌除了可以直接抑制植物病原菌，還能通過(guò)產(chǎn)生抗菌蛋白質(zhì)或酶等抗菌物質(zhì)誘導(dǎo)寄主的抗病能力，也可促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增產(chǎn)[16]。因此利用類芽孢桿菌的拮抗真菌作用防治植物病害、作微生物肥料是一個(gè)潛力巨大的新型領(lǐng)域。

滇黃精為一種重要的藥用植物，其葉斑病、黑斑病、炭疽病是由真菌引起的病害，而膠孢炭疽菌引起滇黃精葉部炭疽病[17-18]。目前農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用使環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重，病蟲害的抵抗力越來(lái)越強(qiáng)，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境陷入惡性循環(huán)，同時(shí)也影響藥用植物的品質(zhì)。所以用生物農(nóng)藥逐漸取代化學(xué)農(nóng)藥勢(shì)在必行。已經(jīng)報(bào)道的植物病害生防細(xì)菌大多數(shù)是從土壤或植物根際土壤微生物中分離篩選得到，但它們的實(shí)際生防效果容易受到如土壤、溫度、濕度等外界環(huán)境的影響，同時(shí)與土壤習(xí)居微生物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[19]。植物內(nèi)生細(xì)菌受到植物組織的保護(hù)，不易受外部惡劣環(huán)境的影響，類芽孢桿菌是一類GC 含量較低、能產(chǎn)芽孢，具有芽孢桿菌屬菌株的某些共性，兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌；由于其具備生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、有效活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)[13]。因此類芽孢桿菌具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力，可成為研發(fā)生防菌劑的理想菌株。

盡管已經(jīng)以該屬的多黏類芽孢桿菌為原料開發(fā)獲得一種微生物菌劑（康地蕾得），它可以直接作用于農(nóng)業(yè)防治青枯病[20]。但是，天然野生型微生物菌劑不足之處在于產(chǎn)品持效期短、見效慢、易受自然環(huán)境影響、競(jìng)爭(zhēng)存活能力有限[21]。本實(shí)驗(yàn)基于生防理念，從藥用植物金毛狗脊中分離到31 株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)抑菌試驗(yàn)篩選出一株拮抗菌株。通過(guò)生理生化測(cè)定及16SrDNA 鑒定，JMGJ01 為類芽孢桿菌。該菌株即豐富了類芽孢桿菌資源庫(kù)，也對(duì)進(jìn)一步研究生物農(nóng)藥、微生物肥料提供資源。