美國(guó)車?yán)遄咏M織培養(yǎng)試驗(yàn)

黃玉玲 朱躍珍 龍 媛 楊寶明

( 1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650502；2. 云南省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224；3. 屏邊縣新華鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南 紅河 661205)

美國(guó)思加圖車?yán)遄佑置髾烟遥–erasus pseudocerasus）為薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬（Cerasus）的落葉喬木，共有30 余種，其中歐甜櫻桃與中國(guó)櫻桃同屬薔薇科，為落葉果樹(shù)中果實(shí)成熟期最早的水果，有“報(bào)春鮮果第一枝” 之美譽(yù)[1]，也是目前栽培效益較高的樹(shù)種之一[2]。車?yán)遄邮a(chǎn)于美國(guó)、加拿大、智利等國(guó)家，近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)車?yán)遄赢a(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，國(guó)外進(jìn)口車?yán)遄铀淹N中國(guó)，車?yán)遄右蝓r味美，果肉細(xì)膩，口感好，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，含有豐富的維生素和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，不僅好吃，還具有調(diào)氣活血，平肝去熱的藥理功效，常吃還能有防癌效果[3]。我國(guó)中、西部地區(qū)的隴海鐵路沿線和四川、云南的高海拔地區(qū)也開(kāi)始嘗試引種不同品種的車?yán)遄硬⒃囋猿晒Γ耘嗝娣e不斷擴(kuò)大，并逐漸成為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)果樹(shù)之一[2]，目前我國(guó)車?yán)遄由a(chǎn)經(jīng)營(yíng)進(jìn)入新的階段，在供給側(cè)結(jié)構(gòu)改革新形勢(shì)下車?yán)遄由a(chǎn)急需轉(zhuǎn)型升級(jí)、調(diào)結(jié)構(gòu)提質(zhì)量、增效益，淘汰低質(zhì)、低效果園，提倡現(xiàn)代生態(tài)種植，綠色高效、省工、省力[4]。當(dāng)前也有車?yán)遄庸麡?shù)苗引種，由于車?yán)遄拥姆N苗繁殖困難，主要是靠嫁接繁殖種苗，受氣候及砧木影響，成活率低，導(dǎo)致供不應(yīng)求等問(wèn)題，很難形成產(chǎn)業(yè)化種植，影響了車?yán)遄拥耐茝V發(fā)展。為保持車?yán)遄拥膬?yōu)良遺傳特性及進(jìn)行苗木快速繁殖，采用思加圖車?yán)遄訕?shù)幼嫩芽作為外植體，誘導(dǎo)叢生芽并獲得生根組培苗，旨在為車?yán)遄訕?shù)的組培快繁生產(chǎn)和新品種培養(yǎng)提供技術(shù)服務(wù)[5]。組織培養(yǎng)不僅繁殖速度快，還可使苗木脫毒，提高種苗的抗性和耐性，使該品種的車?yán)遄庸S化生產(chǎn)成為可能，從而提高車?yán)遄赢a(chǎn)業(yè)的總體經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料于2016 年12 月采自云南瀘西縣林業(yè)試驗(yàn)基地2 年生無(wú)病蟲(chóng)害生長(zhǎng)健壯樹(shù)苗。采用盆栽方法擺放在試驗(yàn)大棚里，應(yīng)用常規(guī)栽培管理方法。待第2 年春季萌發(fā)的枝條，剪取嫩枝條及老枝條作為外植體備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒試驗(yàn)

將不同時(shí)間段發(fā)出的芽分為幼嫩芽（8～10 d）及老芽（15～20 d），用小刀片輕輕切下，用小網(wǎng)袋裝好用自來(lái)水沖洗3～5 min，再稍加洗衣粉搖洗，再用清水沖洗2～3 次。然后在超凈臺(tái)上用2 種消毒劑組合對(duì)外植體處理，滅菌后用無(wú)菌水沖洗3～4 次，無(wú)菌濾紙吸干表面水份。此過(guò)程采用不同時(shí)間梯度[6]進(jìn)行試驗(yàn)，見(jiàn)表1。將處理好的材料接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種消毒處理接種15 瓶，每瓶接種1 個(gè)外植體。

表 1 不同消毒劑及處理時(shí)間對(duì)2 種外植體的影響試驗(yàn)Table 1 The treatment time of different disinfectant combinations for different explants

1.2.2 叢芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

將無(wú)菌芽切成帶1 個(gè)腋芽的單節(jié)，分別轉(zhuǎn)接到6 組不同的配方中。0.2 mg/L NAA 分別與0.5、 1.0、 1.5 mg/L 6-BA 組 合 成 處 理1～3，0.5 mg/L NAA 分別與2.0、2.5、3.0 mg/L 6-BA 組合成處理4～6，共6 組實(shí)驗(yàn)。每組處理10 瓶，3 次重復(fù)，20 d 后觀察叢芽誘導(dǎo)情況。通過(guò)改變激素的用量，篩選適合車?yán)遄訁惭空T導(dǎo)的最佳配方。

1.2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)健壯具有3～4 片葉，株高2～3 cm單苗切下，轉(zhuǎn)接到6 組不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。以MS 作為基本培養(yǎng)基，加瓊脂粉6.0 g/L、糖30 g/L、pH5.8，加入不同濃度配比的6-BA、NAA、IBA（表2），試驗(yàn)設(shè)計(jì)為6 個(gè)處理組合，每處理5 瓶，每瓶5 株，3 次重復(fù)。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1500～2000 lx，光照時(shí)間為10 h/d。

表 2 不同濃度NAA、IBA、IAA 對(duì)植株生根的影響試驗(yàn)Table 2 Effects of different concentrations of NAA, IBA and IAA on rooting of regenerated plants

1.3 測(cè)定及分析方法

當(dāng)苗高為4 cm 左右時(shí)，移栽煉苗，把根部的培養(yǎng)基用清水洗干凈，將生根小苗用25%多多菌靈浸泡3～5 min，即可移栽到育苗盤中，基質(zhì)紅土與腐殖土按體積比為4∶6 配比，相對(duì)濕度80%，30 d 后測(cè)定小苗成活率。

將污染率、褐變率、成活率和生根率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后，應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan 法多重比較分析。按公式（1）～（4）計(jì)算污染率、褐變率、成活率和生根率[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間對(duì)車?yán)遄油庵搀w萌芽效果的影響

由表3 可知，嫩芽處理時(shí)間越短，污染越高，褐化越低，萌芽率就越低。隨著時(shí)間加長(zhǎng)，污染率降低、褐化率升高、萌芽率降低。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，采用75%酒精7 s、0.1%升汞9 min，污染率，褐化率為最佳平衡點(diǎn)，萌芽率可達(dá)60%，為最佳消毒方法。老芽的各項(xiàng)指標(biāo)與嫩芽差異顯著，因此嫩芽是車?yán)遄咏M培的最佳外植體。

表 3 不同處理對(duì)車?yán)遄游廴韭?、褐化率及萌芽率的影響Table 3 Effects of different time combinations of explant disinfection treatment on the contamination rate,browning rate and germination rate of C. pseudocerasus

2.2 不同濃度激素處理對(duì)車?yán)遄訁惭吭鲋诚禂?shù)的影響

由表4 可知，增殖系數(shù)與6-BA 的添加量成正比，當(dāng)6-BA 濃度過(guò)高時(shí)，產(chǎn)生的芽多數(shù)是無(wú)效芽。因此，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L增殖效果最佳。組合增殖誘導(dǎo)7 d 后腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，分化培養(yǎng)25 d 后增殖系數(shù)達(dá)3.92。

表 4 不同質(zhì)量濃度配比對(duì)叢芽增殖系數(shù)影響Table 4 Effects of different mass concentration ratio on the propagation coefficient of cluster buds

2.3 不同生長(zhǎng)素組合對(duì)車?yán)遄釉偕仓晟挠绊?/h3>

由表5 可知，當(dāng)NAA 0.5 mg/L 與IAA 0.2 mg/L組合時(shí)，生根率達(dá)94.6%；當(dāng)NAA 濃度添加到0.6 mg/L 時(shí)，單獨(dú)使用NAA 生根率最高達(dá)100%；當(dāng)NAA 添加到0.7 mg/L 時(shí)，生根率降低為50%，說(shuō)明生長(zhǎng)素濃度偏高反而抑制生根。差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，MS+NAA 0.6 mg/L 為最佳生根培養(yǎng)基。

表 5 不同生長(zhǎng)素組合對(duì)生根影響Table 5 Effect of different auxin combinations on rooting

3 結(jié)論與討論

美國(guó)思加圖車?yán)遄拥慕M織培養(yǎng)參數(shù)：1）外植體消毒：75%酒精浸泡7 s，0.1%升汞浸泡9 min[7]；2）芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，污染率低、褐化率較低、萌芽率60%；3）最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.6 mg/L，生根率為100%；4）移栽煉苗基質(zhì)為紅土與腐殖土體積比為4∶6，蓋膜保濕溫度（25±2）℃，濕度80%，成活率達(dá)90%以上。

在車?yán)遄咏M織培養(yǎng)中影響芽分化的因素很多，主要有外植體的選擇與外植體的滅菌方法、培養(yǎng)基激素配比等。正確選擇外植體及滅菌的方法是組織培養(yǎng)關(guān)鍵的第1 步，培養(yǎng)基及激素的選擇是植物體離體培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，選擇適合的培養(yǎng)基有利于外植體的發(fā)育和生長(zhǎng)。

木本植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的外植體褐變現(xiàn)象較為普遍，褐變是由于外植體材料在切口處分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物導(dǎo)致，處理不當(dāng)會(huì)阻塞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，可直接致死[8]。趙書(shū)珍等[9]在火炬樹(shù)（Rhus typhina）快速繁殖技術(shù)的研究中，以MS 為基本培養(yǎng)基，其莖段會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象，成活率僅為40%，植物激素及其濃度的配比是植物在該培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵，在組織培養(yǎng)中木本植物易褐化比其他植物較難培養(yǎng)成功。車?yán)遄咏M培快繁有過(guò)一些研究，但采用室內(nèi)盆栽方法及選擇不同時(shí)段采集外植體的方法尚未見(jiàn)研究。本研究外植體采集方法是采用室內(nèi)盆栽方法及不同時(shí)段采集外植體取芽，容易獲得滅菌外植體。從結(jié)果可以看出，幼嫩芽外植體存在著較大的優(yōu)勢(shì)。以上研究有助于解決車?yán)遄佑绯苫盥实停鐣r(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)生苗長(zhǎng)勢(shì)參差不齊等問(wèn)題。對(duì)車?yán)遄咏M培快繁技術(shù)研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，為生產(chǎn)帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的技術(shù)指導(dǎo)。