液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中喹啉銅的殘留量

徐 娟*， 李敏青， 邵琳智， 孫靈慧， 莊 嘉

(廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東廣州 510623)

喹啉銅是一種有機銅螯合物殺菌劑，其殺菌作用主要取決于釋放出的Cu2+濃度，但喹啉銅使用不當會污染環(huán)境，并在生物體內(nèi)富集，進而危及人體健康。目前，我國國家標準《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[1]和香港特別行政區(qū)《食物中除害劑殘余管理規(guī)例》[2]中都規(guī)定喹啉銅的最大殘留限量，涉及番茄、蘋果、黃瓜、梨和日本柿子。

早期對于喹啉銅檢測技術(shù)的報道主要集中在以下兩類：一是采用不同方式測定喹啉銅中的銅，再轉(zhuǎn)換計算喹啉銅的含量[3],或者利用銅離子氧化發(fā)光氨，通過分光光度計測定光吸收進而測出喹啉銅的含量[4]。這種思路的測定方法存在的主要問題是容易受到環(huán)境中銅本底的影響，前處理的儀器復(fù)雜，不利于方法的推廣。第二種是采用各種破絡(luò)劑，使喹啉銅解離或衍生后，測定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，這些方式測定存在的主要問題是前處理技術(shù)要求高，使用有毒有害的衍生試劑[5 - 6]。近年來國內(nèi)已有采用反相高效液相色譜來測定喹啉銅的文獻報道，其主要原理是在流動相中加入緩沖鹽類或者使用十二烷基硫酸鈉、三氟乙酸等離子對試劑，通過延長喹啉銅的保留時間，達到分離測定的目的。另外在前處理中，通常需要先使用較大體積的乙腈混合強酸/強堿超聲提取后鹽析，再用正己烷或者石油醚反萃，操作復(fù)雜且由于其選擇性低，導致檢出限難以滿足要求[7 - 9]。

綜合文獻調(diào)研，未發(fā)現(xiàn)有應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對蔬菜和水果中喹啉銅殘留量進行測定的相關(guān)報道，故本研究采用簡單的液-液萃取(LLE)技術(shù)作為前處理手段，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了蔬菜和水果中喹啉銅殘留量的檢測方法。本方法穩(wěn)定、簡便、靈敏，覆蓋所涉及到的食品基質(zhì)并滿足最大殘留限量的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantiva串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，Ultimate 3000液相色譜儀(美國，Thermo Fisher公司)；Mill-Q去離子水發(fā)生器(美國，Millipore公司)；Sigma-3-18K離心機、Sigma-1-14離心機(德國，Sigma公司)；MS3 Basic渦旋混合器、T25勻漿刀(德國，IKA公司)；超聲清洗儀(SONO Swiss公司)。

喹啉銅標準物質(zhì)購自Dr.Ehrenstorfer公司(0.25克/瓶，純度≥99.0%)；乙腈、乙酸(色譜純，美國TEDIA Company)；無水MgSO4、PSA和C18粉(分析純，美國Sigma-Aldrich，Missouri)；乙酸銨(質(zhì)譜級，德國Fluka Chemie AG,Buchs)。實驗所有用水均為Mill-Q超純水。

蘋果、梨、黃瓜和柿子均購自當?shù)爻小?/p>

1.2 標準溶液的配制

準確稱取喹啉銅標準品10 mg(精確到0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.1 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃以下避光保存，有效期6個月。準確吸取喹啉銅標準儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此標準溶液為1 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理

稱取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 1%乙酸，超聲15 min，4 000 r/min離心5 min，提取液收集于25 mL塑料容量瓶中；重復(fù)上述操作，合并上清液并以1%乙酸定容至25 mL。移取1 mL，加入裝有50 mg PSA和50 mg C18粉末的高速離心管里，渦旋1 min后，以12 000 r/min離心5 min，取0.5 mL凈化后的提取液，加入0.25%甲酸定容到1 mL后混合均勻，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后供LC-MS/MS分析。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：GL Inertsil ODS-4柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：采用乙腈(A)和0.25%甲酸水(B)組成的流動相進行梯度洗脫，洗脫條件：0～5 min，A 由5.0%～30.0%;5.01 min，A由30.0%～5.0%;5.01～10.0 min A保持5.0%;10.0 min停止。流速:0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

離子源:電噴霧離子源(ESI),溫度350 ℃，電噴霧電壓3 500 V；傳輸管溫度：300 ℃；掃描方式:正離子模式;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);鞘氣(Sheath Gas):6 L/min；輔助氣(Aux Gas):8 L/min；吹掃氣(Sweep Gas):1 L/min；定性與定量離子對、去簇電壓(RF)、碰撞能量(CE)等參數(shù)見表1。

表1 喹啉銅質(zhì)譜條件參數(shù)

*Quantitative ion pair.

2 結(jié)果與討論

2.1 喹啉銅與8-羥基喹啉的相關(guān)色譜研究

喹啉銅是有機銅螯合物，其在酸性條件下不穩(wěn)定，很容易解離出Cu2+，從而轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉，在傳統(tǒng)的碘量滴定法中就是利用這一原理進行測定。本文基于這個原理，通過測定8-羥基喹啉從而實現(xiàn)測定喹啉銅的殘留量。為了進一步確定喹啉銅和8-羥基喹啉的關(guān)系，實驗分別對15 mg/L 8-羥基喹啉和喹啉銅溶液進行紫外-可見光譜掃描，結(jié)果分別見圖1和圖2。從光譜圖中可以清楚看出，二者具有一致的最大吸收波長。根據(jù)喹啉銅和8-羥基喹啉的分子量和結(jié)構(gòu)式，理論上1 mg/kg的喹啉銅完全轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉應(yīng)為0.825 mg/kg。為了確定喹啉銅的轉(zhuǎn)化率，用1%乙酸溶液配制相同質(zhì)量濃度的15 mg/L喹啉銅和8-羥基喹啉銅溶液，以液相色譜儀測定，以8-羥基喹啉計算喹啉銅，結(jié)果為13 mg/L，轉(zhuǎn)化率為105%。同時，二者一致的保留時間也再一次證實在本方法條件下，可以認為喹啉銅全部轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉(圖3)。

雖然喹啉銅在測定的過程中轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉，但是世界主要國家和地區(qū)的規(guī)定中所確定的殘留定義物為喹啉銅，而本實驗配制的標準溶液使用喹啉銅標準品配制，其質(zhì)量濃度可以喹啉銅為計算標準。因此，按照本文方法依然把最后得到的色譜峰認為是喹啉銅的色譜峰，這樣就不需要采用8-羥基喹啉來進行定量，然后再轉(zhuǎn)換為喹啉銅，以利于標準的方便使用。同時，喹啉銅的有效成分是通過其釋放出的Cu2+實現(xiàn)的，8-羥基喹啉無法替代喹啉銅達到防治病蟲害的作用，同時后續(xù)方法驗證實驗時在空白實驗中均未發(fā)現(xiàn)8-羥基喹啉殘留。

圖1 8-羥基喹啉的紫外-可見(UV-Vis)光譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of 8-hydroxyquinoline

圖2 喹啉銅的紫外-可見(UV-Vis)光譜圖Fig.2 UV-Vis spectrum of oxine copper

2.2 檢測條件的優(yōu)化

圖3 喹啉銅(峰1)和8-羥基喹啉(峰2)的色譜圖Fig.3 Chromatograms for oxine copper(peak 1) and 8-hydroxyquinoline(peak 2)

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化喹啉銅是一種極性很強的化合物，根據(jù)文獻報道[7 - 9]，在選用反相液相色譜進行測定時，采用C18色譜柱,而且均需要加入緩沖鹽類(磷酸鹽體系或乙酸鈉-乙酸緩沖體系)來調(diào)節(jié)溶液至體系呈現(xiàn)酸性(pH=2.8～3.0)，或者在流動相中加入十二烷基硫酸鈉、三氟乙酸等離子對試劑。因此，本實驗首先使用文獻報道中使用的普通Aglinet Eclipse C18色譜柱，試驗了乙腈+水，甲醇+水，乙腈+5 mmol/L甲酸銨，甲醇+5 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸，乙腈+20 mmol/L七氟丁酸共6種流動相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，緩沖鹽和離子對試劑的加入，在使用串聯(lián)質(zhì)譜儀器作為檢測器時，對化合物的響應(yīng)有明顯抑制，而0.25%的甲酸則對于峰形和響應(yīng)值有改善，故選擇0.25%甲酸+乙腈流動相體系。實驗分別嘗試了C18色譜柱、T3色譜柱、Hilic色譜柱等，最終確定GL Inertsil ODS-4色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)，采用乙腈-0.25%甲酸水溶液作為流動體系，流速為0.2 mL/min。該條件下目標峰的保留時間為6 min左右。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化實驗在ESI+模式下，采用蠕動泵連續(xù)進樣，對喹啉銅進行母離子全掃描。結(jié)果表明，當以0.25%甲酸配制喹啉銅標準溶液(1 mg/L)，進行母離子掃描時，質(zhì)譜圖上可以看到喹啉銅的母離子峰m/z=351.95和8-羥基喹啉的母離子峰m/z=146.05(圖4)；而以甲醇配制喹啉銅標準溶液(1 mg/L)，進行母離子掃描時，質(zhì)譜圖上也可以看到喹啉銅的母離子峰m/z=351.95和8-羥基喹啉的母離子峰m/z=146.03(圖5)。這充分證明喹啉銅發(fā)生了源內(nèi)裂解，而且，m/z=146.0是優(yōu)勢離子，這與文獻報道[10]相一致。鑒于上述液相色譜部分已經(jīng)確定喹啉銅在酸性條件下徹底轉(zhuǎn)化成8-羥基喹啉，同時質(zhì)譜碎片也證實，喹啉銅會裂解產(chǎn)生8-羥基喹啉的母離子峰為優(yōu)勢離子，故選定m/z=146.0作為母離子測定。

圖4 喹啉銅標準溶液質(zhì)譜圖(1 mg/L，0.25%甲酸)Fig.4 Mass spectra of oxine copper standard solution(1 mg/L,0.25% formic acid)

圖5 喹啉銅標準溶液質(zhì)譜圖(1 mg/L，甲醇)Fig.5 Mass spectra of oxine copper standard solution(1 mg/L,methanol)

對于不同的儀器確實可能存在不同的優(yōu)勢碎片，即使是同一儀器，采用Thermo TSQ Quantiva優(yōu)化采集多次調(diào)諧時也會出現(xiàn)不同的優(yōu)勢離子，其中m/z=118為始終穩(wěn)定出現(xiàn)的離子碎片，為了得到穩(wěn)定可靠的離子對信息，本實驗同時將得到的離子對信息在實際樣品中進行對比，最后確定質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 破絡(luò)劑的選擇參照國內(nèi)發(fā)明專利中采用Na2S作為破絡(luò)劑測定喹啉銅[11]，按照專利方法進行了操作，但實驗結(jié)果顯示對于目標色譜峰存在干擾峰且噪音背景高。根據(jù)文獻報道，由于喹啉銅直接在酸性條件下就容易釋放出Cu2+，以日本藥典(JP XI)和我國臺灣規(guī)定為例，對于喹啉銅作為一種農(nóng)藥的有效成分檢測其含量時，主要是將喹啉銅通過酸性條件下轉(zhuǎn)變成8-羥基喹啉，使用氣相色譜儀或者紫外分光光度計測定，再通過摩爾系數(shù)轉(zhuǎn)化計算產(chǎn)品中喹啉銅的實際含量[12 - 13]。因此后續(xù)優(yōu)化實驗設(shè)計采用不同的酸性溶液直接提取。

2.3.2 提取溶劑的選擇喹啉銅不易溶解于水和有機溶劑，微溶于喹啉、吡啶、冰乙酸、氯仿和弱酸，溶于強酸，遇堿分解，根據(jù)這個特點并且結(jié)合文獻，選取1%乙酸、0.1%甲酸、甲醇和乙腈，考察其提取效率。稱取5 g空白試樣(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入0.1 mL濃度為50 mg/L 喹啉銅的標準溶液，分別加入1%乙酸、0.1%甲酸、甲醇和乙腈各10 mL，超聲15 min后，以4 000 r/min離心5 min，取上清液倒入25 mL塑料容量瓶中，再加入10 mL上述提取液，再次超聲提取15 min后，以4 000 r/min離心5 min，合并上清液并以提取液定容至25 mL，取0.5 mL提取液，加入0.25%甲酸定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后供LC-MS/MS分析。以化合物的響應(yīng)值和譜圖的背景干擾為篩選條件(圖略)，結(jié)果表明提取效率最好的是1%乙酸，故提取溶劑選擇1%乙酸。

2.3.3 提取時間的選擇實驗分別設(shè)置超聲時間為15 min和30 min，考察提取時間對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲時間為15 min的效果最好，因此最終確定以1%乙酸提取后超聲15 min。

2.3.4 凈化方式的選擇對于得到的提取液，考慮了三種凈化方法：①150 mg Na2SO4+50 mg PSA，②50 mg PSA+50 mg C18，③無凈化。取1 mL上清提取液分別加入裝有上述凈化粉末的高速離心管中，渦旋后采用12 000 r/min離心10 min，取0.5 mL凈化液用0.25%甲酸定容至1 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后供LC-MS/MS分析。上機測定結(jié)果顯示化合物的響應(yīng)結(jié)果幾乎無差異，背景干擾同樣未顯示存在顯著區(qū)別。考慮到本方法主要適用的基質(zhì)為水果和蔬菜，實驗采用50 mg PSA+50 mg C18這種凈化組合方式。

2.4 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)評價

配制濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的喹啉銅標準系列溶液，在確定的實驗條件下進樣，測定其峰面積，以濃度x(mg/L)為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線。在選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，喹啉銅質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性方程為：y=2.36×104x-5.19×104(R2>0.99)。

實驗考察了基質(zhì)效應(yīng)對于目標物響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)對于響應(yīng)存在不同程度的抑制，但差異并不顯著。同時根據(jù)儀器特性，在空白基質(zhì)中添加水平0.1 mg/kg進行定量限確認，在這些代表基質(zhì)樣品的添加回收中，喹啉銅色譜峰的信噪比(S/N)均大于10，可以準確的進行喹啉銅的定性和定量，因此最后確定方法的定量限(LOQ)為0.1 mg/kg。根據(jù)前文已確定的條件，選擇了番茄、梨、蘋果、黃瓜和柿子作為實驗基質(zhì)，選擇LOQ、0.5倍最大殘留限量(MRL)、1倍MRL和2倍MRL共計4個水平，分別添加喹啉銅的標準品，每個水平進行了6個平行實驗，結(jié)果見表2。

表2 喹啉銅在果蔬中的加標回收率(n=6)

(續(xù)表2)

MatrixAdded(mg/kg)Found(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Pear0.100.10090.4-11510.51.000.89485.4-93.53.722.001.7980.5-99.07.744.003.5885.0-98.85.49Apple0.100.088083.7-91.13.141.000.89986.0-1036.992.001.8183.0-93.54.204.003.8290.5-1003.27Cucumber0.100.090085.1-99.55.421.000.89282.8-95.55.912.001.7883.0-93.04.504.003.4483.0-90.03.90Persimmon0.100.095083.3-10912.11.000.87984.6-92.32.902.001.7182.5-99.07.964.003.3481.3-86.32.65

2.5 實際樣品分析

目前，本方法已應(yīng)用于日常檢測工作。通過近兩年來對近200個樣品的檢測工作，發(fā)現(xiàn)約有10個樣品中喹啉銅殘留量在0.1～0.2 mg/kg之間，沒有檢出不合格的產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本文所建立方法已應(yīng)用于蔬菜和水果中喹啉銅的日常檢測工作，填補了我國目前尚未出臺任何相關(guān)檢測喹啉銅標準的技術(shù)空白。通過近兩年來對大量樣品中喹啉銅的檢測工作，證實了該方法穩(wěn)定有效，并通過監(jiān)控數(shù)據(jù)，對生產(chǎn)基地進行用藥指導，有效避免了由于蔬菜、水果中喹啉銅殘留可能發(fā)生的貿(mào)易摩擦和損失。