QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法同時分析蜂蜜中33種生物堿

杜鳳君， 徐敦明*， 張志剛， 林玉萍， 林立毅，賴國銀， 趙海軍， 劉 舟， 王 娟， 呂美玲

(1.廈門海關技術中心，福建廈門 361026；2.廈門醫(yī)學院，福建廈門 361023；3.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

生物堿是一類具有含氮雜環(huán)結構的堿性物質，他們具有高效的藥理作用和生理活性。臨床上，治療劑量的阿片類生物堿具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抑制腸蠕動的作用；馬錢子類生物堿具有治療四肢麻木、癰瘡腫毒、咽喉腫痛的功效；荷葉堿類生物堿具有清熱解毒、降脂減肥、止血散瘀等作用[1 - 2]。然而，許多生物堿毒性極強，攝入毫克量級即可對人體造成傷害，具有致命性毒性。過量誤食、誤服含有毒生物堿類食物、藥物將導致食物中毒或藥物成癮。例如，長期食用含阿片類生物堿的食物可產生成癮性，嚴重時會造成神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)損傷；過量服用馬錢子堿會導致中樞神經系統(tǒng)興奮、反射亢進，造成中樞神經系統(tǒng)疲憊與麻痹而死亡，嚴重危害人體健康[3 - 4]。

蜂蜜是天然甜類物質，由蜜蜂采集植物花蜜釀造，故而花蜜種類決定了蜂蜜的品質。自然界中某些植物的花粉和花蜜中含有天然毒素的生物堿，比如吡咯里西啶生物堿和異喹咻類生物堿[5]。近年來，包括蜂產品在內的多種食品中生物堿中毒事件時有發(fā)生[6 - 8]，但目前國內對生物堿的研究并不多[9 - 10]。生物堿的測定方法主要有化學分析法、分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等方法[11]。高效液相色譜-串聯質譜法結合了液相色譜高效的在線分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度，具有同時檢測多種不同性質目標物的能力，在藥物多殘留分析中顯示出越來越廣闊的應用前景?；疱伒琢现袉岱?、可待因、罌粟堿等阿片類生物堿可以采用QuEChERS法快速提取后，用液相色譜-串聯質譜法進行準確測定；蜂蜜中倒千里光堿、克氏千里光寧等吡咯啶類生物堿可以采用強陽離子型固相萃取柱進行富集和凈化，然后用高效液相色譜-串聯質譜法進行定性和定量分析[9 - 10]?，F有的液相色譜-串聯質譜法大多只適用于檢測化學性質相近的一類生物堿[12 - 14]，對化學性質差別巨大的多類生物堿同時檢測尚未建立有效的檢測方法。

本研究選取了結構差異顯著，化學性質懸殊的33種生物堿為研究對象，旨在建立蜂蜜中多種類多類型生物堿的液相色譜-串聯質譜測定方法。本方法操作簡易、檢出限低、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以快速、準確地進行定性定量分析，從而為蜂蜜中有毒生物堿的安全評價提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀-6470三重四極桿串聯質譜儀(美國，Agilent公司)；漩渦混勻器(德國，IKA公司)；離心機(上海安亭科學儀器廠)。

33種生物堿標準品購自上海安譜科學儀器有限公司，中英文名稱及CAS號詳見表1。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制分別準確稱取33種生物堿標準品適量(精確至0.1 mg)，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制為1.0 g/L的標準儲備液，于-20 ℃下避光保存。實驗時根據需要，梯度稀釋成標準工作液。

1.2.2 樣品前處理準確稱取5 g蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水，200 μL氨水，10 mL乙腈，混勻。然后加入NaCl至飽和，渦旋2 min，離心，移出上層有機相。下層水相再加入10 mL乙腈，渦旋2 min，離心，合并上層有機相。氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。在定容液中加入0.2 g PSA粉末，渦旋混勻1 min，以15 000 r/min離心3 min。上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測。

1.2.3 液相色譜-質譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm；美國Agilent公司)，流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，40%B;1.0～3.0 min,40%～60%B,3.0～5.0 min,60%～70%B;5.0～5.1 min,70%～90%B;5.10～10 min，90%～100%B;10.0～12.0 min，100%B；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10.0 μL。離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；霧化氣溫度300 ℃，干燥氣流速8.0 L/min，霧化器壓力35 psi，鞘流氣溫度400 ℃，鞘流氣流速12.0 L/min，毛細管電壓3 500 V，噴嘴電壓500 V。33種生物堿的保留時間、定性離子、定量離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數見表1。

表1 33種生物堿的保留時間、定量離子、定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數

(續(xù)表1)

No. CompoundCAS No.Retention time(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Fragmentor(V)Collision energy(eV)15Protopine130-86-95.664354.4149.0,189.0?16029,4116Ephedrine hydrochloride50-98-67.491202.6127.1,144.1?11045,2117Pilocarpine hydrochloride54-71-76.271245.7189.0,216.0?34057,4918Retrorsine480-54-63.879352.441.2,67.2?14577,5319Senecionine130-01-86.290336.4292.1,320.0?16033,3320Monocrotaline315-22-03.425326.4193.9,120.0?12033,4021Scopolamine51-34-33.832303.8137.9,156.1?12023,1522Tetrahydropalmatine2934-97-65.729355.473.1,189.0?15030,3023Coptisine chloride6020-18-45.699356.8165.1,193.0?14525,4024Benzoylaconine466-24-07.253604.7554.3,105.0?20541,6125Sophoridine6882-68-43.429249.4131.1,149.2?19045,4126Evodiamine518-17-26.293304.4216.0,289.0?27065,3727Chelerythrine34316-15-98.967349.4219.1,305.1?15550,3028Colchicine64-86-88.039399.9309.9,358.1?13532,2229Strychnine57-24-94.072334.9156.1,184.1?13555,4430Pseudoephedrine hydrochloride345-78-83.948166.0133.0,148.1?8014,1031Camptothecin7689-3-48.913348.8249.0,305.0?13533,2532Antu86-88-47.490208.8186.0,144.1?13520,2033Atropine51-55-84.347290.093.0,124.1?13535,26

*quantitative ions.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

生物堿是一類具有含氮雜環(huán)結構的堿性物質，酸性條件下含氮結構單元容易被質子化，適合采用電噴霧正離子多反應監(jiān)測模式進行測定。本文考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈4種流動相的分離效果。實驗發(fā)現，乙腈對生物堿的洗脫能力比甲醇強，以乙腈為流動相時所有目標物在3 min內被全部洗脫，流動相的酸化與否不會造成出峰時間的變化。大多數生物堿在甲醇中的響應大于乙腈中的響應，鬼臼毒堿、10-羥基喜樹堿、茄堿、秋水仙堿、可的松、喜樹堿、安妥等在乙腈中響應比在甲醇中的高；同時，水相使用甲酸酸化后，各目標化合物峰都比使用未酸化的水相具有更高的響應。生物堿標準品混合溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 33種生物堿標準品混合溶液(50 μg/L)總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of 33 alkaloids standard solution

2.2 提取條件的選擇

生物堿具有環(huán)狀結構，能溶于有機溶劑，與酸成鹽后能溶于水。根據生物堿的溶解特性及兩性結構，本文考察了乙腈、乙醚、乙酸乙酯的提取效果。取三試管，分別稱取5 g蜂蜜，加入5 mL水，加入生物堿標準工作液0.5 mL，加入200 μL氨水，加入NaCl至飽和后，分別采用10 mL乙腈、乙醚、乙酸乙酯提取，渦旋混勻，5 000 r/min離心，取上清液過膜上機，不同提取溶劑回收率見圖2。圖2表明提取效率：乙腈>乙醚>乙酸乙酯，后續(xù)的研究采用乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取液對33種生物堿回收率的影響Fig 2 Effect of extraction on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.3 凈化方法的選擇

本文考察了PSA粉末、C18粉末、MCX小柱、HLB小柱對樣品的凈化效果。稱取適量試樣4份，2份供基質分散固相萃取(QuEChERS)凈化，2份供固相萃取小柱凈化。在樣品中加入50 μL生物堿標準中間液，混勻，加入NaCl至飽和，加入10 mL乙腈，渦旋，離心，取上清液。殘渣再加入10 mL乙腈，渦旋，離心，合并有機相，氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。一份加入0.2 g PSA粉末，一份加入0.2 g C18粉末，渦旋，離心，過膜后，上機測定。一份過MCX小柱，一份過HLB小柱，洗脫液氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。定容液過膜備測。樣品回收率見圖3。鹽酸麻黃堿、野百合堿、槐定堿、白屈菜紅堿、安托在4種凈化方式下回收率均小于50%，其余29種生物堿采用HLB小柱凈化的回收率最差；采用C18粉末凈化次烏頭堿、荷葉堿、鬼臼毒堿、烏頭堿、茄堿、苦參堿、喜樹堿回收率不佳；采用PSA粉末、MCX柱凈化各生物堿回收率水平相當，回收率在60%～120%之間。從節(jié)約實驗時間、溶劑以及實驗成本角度考慮，本實驗采用PSA粉末進行凈化。

圖3 不同凈化方式對33種生物堿回收率的影響Fig.3 Effect of clean-up methods on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.4 基質效應評價

基質效應是指在目標物測試過程中，由于其他物質的存在，造成目標物離子化過程受到增強或抑制，從而影響方法的準確度[17]。當前基質效應的評價方法有標準曲線法和相對響應值法。本文采用標準曲線法(基質效應=基質匹配溶液在線性范圍內斜率/溶劑標準溶液在線性范圍內斜率×100%)考察了生物堿在蜂蜜中的基質效應，用空白樣品提取液為標準溶液的稀釋溶液，使標準溶液和樣品溶液具有相同的離子化條件。研究結果表明，喜樹堿、10-羥基喜樹堿、茄堿表現為基質增強效應(105%～110%)，其他目標物在基質中的都為基質抑制效應(60%～90%)，其中鬼臼毒素的基質抑制效應最為強烈(20%～60%)。

為了確保測定的準確性，消除基質干擾，本研究采用基體匹配法進行定量。用不含分析目標物的蜂蜜樣品的提取液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L系列標準溶液。以濃度(x，μg/L)為橫坐標，定量離子峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，最終得到33種生物堿的線性方程、相關系數，見表2。結果表明，在0.5～50 μg/L濃度范圍內，33種生物堿均具有良好的線性關系。在蜂蜜基質中添加33種生物堿，考察方法的檢出限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)，33種生物堿的檢出限為0.33～6.7 μg/kg，定量限為 1.0～20 μg/kg(表2)。

表2 33種生物堿標準溶液的線性方程、相關系數、檢出限及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

加標回收和精密度實驗，添加2、4、20 μg/kg 3個濃度水平目標物，重復6次測定，其平均回收率和相對標準偏差見表3。新烏頭堿、次烏頭堿、番木鱉堿、荷葉堿、鬼臼毒堿、烏頭堿、檳榔堿、毛果蕓香堿、鉤吻堿、毒扁豆堿、茄堿、D -四羥基藥根堿、去氫駱駝蓬堿、苦參堿、原阿片堿、鹽酸匹魯卡品、惹桌堿、千里光堿、東莨菪堿、延胡索乙素、鹽酸黃連堿、苯甲酰烏頭原堿、吳茱萸堿、秋水仙堿、士的寧、鹽酸偽麻黃堿、喜樹堿、阿托品28種生物堿回收率范圍為64.5%～100.2%，相對標準偏差在4.7%～14.6%之間，方法回收率和精密度良好。鹽酸麻黃堿、野百合堿、槐定堿、白屈菜紅堿、安妥5種生物堿的回收率低，無法滿足相關技術要求，但可以做為定性分析。

表3 33種生物堿在蜂蜜中的回收率和相對標準偏差(n=6)

(續(xù)表3)

No.CompoundRecovery(%)RSD(%)10Eserine81.8-96.77.511Solanine74.4-83.95.212Tetrahydrojatrorrhizine73.3-86.37.513Harmine72.7-90.110.314Matrine61.2-79.410.715Protopine74.4-94.211.016Ephedrine hydrochloride6.0-8.615.117Pilocarpine hydrochloride71.4-87.29.618Retrorsine68.8-89.611.119Senecionine68.7-91.113.520Monocrotaline11.9-18.67.421Scopolamine85.6-97.75.822Tetrahydropalmatine73.0-86.99.123Coptisine chloride77.3-91.711.624Benzoylaconine67.0-85.612.125Sophoridine18.7-25.7141.426Evodiamine68.2-89.112.427Chelerythrine5.5-13.410.628Colchicine81.4-98.69.829Strychnine83.0-91.14.130Pseudoephedrine hydrochloride68.8-85.59.331Camptothecin73.5-90.19.832Antu6.19-7.510.133Atropine86.3-93.73.6

2.6 實際樣品的檢測

根據本文建立的方法，對20個市售蜂蜜樣品中的生物堿進行測定。其中，6個樣品中檢出生物堿，6個樣品中檢出了野百合堿，有3個樣品還檢出千里光堿。由于本方法對野百合堿的回收率低，定量不準確，但定性準確，可判定6個樣品中含有野百合堿。

3 結論

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜測定蜂蜜中33種有毒生物堿的方法。在0.5～50 μg/L濃度范圍內，33種生物堿均具有良好的線性關系，其檢出限分別在0.33～6.7 μg/kg和1.0～20 μg/kg范圍。對蜂蜜基質中進行2、4、20 μg/kg 3水平的加標回收試驗，經基質匹配標準曲線校正，33種生物堿中28種的回收率范圍為64.5%～100.2%，相對標準偏差在4.7%～14.6%之間，方法回收率和精密度良好；5種的回收率低，無法滿足相關技術要求，只能定性分析。本方法操作簡單，靈敏度高，可以快速地進行定性和定量分析，從而為蜂蜜中有毒生物堿的安全評價提供依據。