產(chǎn)瓦倫西亞烯釀酒酵母的表達(dá)載體適配及發(fā)酵碳氮源優(yōu)化

陳和鋒 朱晁誼 李爽

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

瓦倫西亞烯（Valencene）是一種天然倍半萜化合物，瓦倫西亞烯又稱巴倫西亞橘烯，是一種具有似柑橘香氣的黃色液體［1］。瓦倫西亞烯常見于各類柑橘果實(shí)的精油中，被廣泛應(yīng)用于香水、香皂等工業(yè)制造上［2］，而且許多倍半萜類化工品如高附加值化合物圓柚酮（Nootkatone）也是通過瓦倫西亞烯氧化合成。除此之外，由于它具有水果香味，在商業(yè)上可被用作飲料和食品的添加劑，市場(chǎng)的需求量每年可達(dá)10000 kg，另外每年還有5000 kg 瓦倫西亞烯用于合成圓柚酮［3］，因而應(yīng)用前景巨大。

目前工業(yè)上獲得瓦倫西亞烯的方法主要是以柑橘精油為原料，通過蒸餾、萃取等工藝分離出來，但是由于柑橘果實(shí)中瓦倫西亞烯的濃度較低（按重量計(jì)為0.2%-0.6%），從柑橘精油中分離獲得瓦倫西亞烯的過程較為繁瑣且費(fèi)用較高［4］。此外，由于柑橘精油是通過將柑橘榨汁后余下的柑橘皮冷榨而獲得的，而我國(guó)柑橘一般是以鮮果消費(fèi)為主，柑橘榨汁工業(yè)并不發(fā)達(dá)，故也缺少它的副產(chǎn)物——柑橘精油，這便使得瓦倫西亞烯十分稀缺，價(jià)格昂貴，從而使瓦倫西亞烯的應(yīng)用受到了極大的限制。

為了滿足瓦倫西亞烯愈發(fā)增長(zhǎng)的需求，利用基因改造優(yōu)化過的微生物細(xì)胞生產(chǎn)瓦倫西亞烯成為經(jīng)濟(jì)可行的方法，因?yàn)槲⑸锛?xì)胞具有生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)成本低廉且發(fā)酵產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)，可以避免在植物萃取過程中帶來的高能耗、低產(chǎn)量及環(huán)境污染問題。而真菌中的模式生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）則是目前最常用的基因表達(dá)宿主之一，且因?yàn)獒劸平湍甘堑谝粋€(gè)完成基因組測(cè)序的真核生物，易于進(jìn)行基因敲除，遺傳性狀也較為穩(wěn)定［5-6］。因而我們需要研究萜類化合物在釀酒酵母體內(nèi)的合成途徑，并尋找合適的載體進(jìn)行構(gòu)建。為了賦予酵母倍半萜合成能力，需要人為引入相應(yīng)的外源倍半萜合成酶，這些外源合成酶大部分來源于芳香植物。

MVA 途徑是釀酒酵母體內(nèi)合成各類萜類化合物的代謝途徑，從乙酰輔酶acetyl-coA 開始，經(jīng)過一系列酶作用到達(dá)中間產(chǎn)物FPP，并經(jīng)由不同的萜類合成酶生成相應(yīng)的萜類化合物，如在角鯊烯合成酶（由erg9編碼）的作用下流向麥角固醇（Ergosterol）合成途徑，因而為了提高通往合成目的產(chǎn)物的FPP流量，可以減弱erg9基因的表達(dá)。但由于麥角固醇對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，無法將erg9基因的完全敲除，已有研究通過將erg9基因原有的啟動(dòng)子替換為較弱的啟動(dòng)子MET3，減少麥角固醇途徑的流量，從而實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物產(chǎn)量的提高［7-8］。此外，?zaydin等［9］發(fā)現(xiàn)將rox1基因敲除后，MVA 途徑中間產(chǎn)物甲羥戊酸的表達(dá)水平得到大幅提高，其他研究也發(fā)現(xiàn)rox1基因在甲羥戊酸途徑和麥角固醇生物合成中是抑制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，被敲除之后可提高M(jìn)VA 途徑通量［10-11］。

綜上，本研究嘗試引入來自植物黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶基因（CnVS）到釀酒酵母體內(nèi)，使得釀酒酵母能利用簡(jiǎn)單培養(yǎng)基合成瓦倫西亞烯，并結(jié)合代謝途徑改造和表達(dá)載體適配提高瓦倫西亞烯產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株 本實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒、菌株如表1 和表2 所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒

1.1.2 主要試劑和儀器 本實(shí)驗(yàn)所用限制性內(nèi)切酶及2×DreamTaq Green PCR 購(gòu)自上海Thermo Fisher Scientific 公司，T4 連接酶購(gòu)自北京New England BioLabs 公 司，2×PrimerSTAR Max Premix 及DNA Marker 購(gòu) 自 大 連 的TaKaRa 公 司，ClonExpress II 重組試劑盒購(gòu)自南京的Vazyme 公司，Cycle-Pure Kit 購(gòu) 自O(shè)MEGA bio-tek 公 司，S.c.EasyComp Transformation Kit 購(gòu)自美國(guó)的Invitrogen 公司。

本實(shí)驗(yàn)中所用主要儀器包括雙層全溫振蕩搖床，PCR 基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Aligent 公司的氣相色譜儀GC 7890A 及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890-5975C，美國(guó)Waters 公司的高效液相色譜儀，上海Thermo Fisher Scientific 公司的超低溫冰箱。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

1.1.3.1 Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（L-1） 稱取10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl 溶于蒸餾水。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，在LB 培養(yǎng)基中再加入20 g 瓊脂粉即可。配制LB/Amp+抗性培養(yǎng)基時(shí)，在LB 培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60℃左右后，在超凈工作臺(tái)中以1∶1000 比例加入氨芐青霉素（100 mg/mL）即可。

1.1.3.2 三缺型SD 或SG 培養(yǎng)基（L-1） 配制ΔLeu-ΔTrp-ΔUra 的三缺型SD 或SG 培養(yǎng)基時(shí)，稱取20 g葡萄糖或半乳糖溶于蒸餾水。滅菌冷卻后，在超凈工作臺(tái)中按1∶10 的比例加入10×酵母氮源（YNB）溶液和10×DO Supplement 溶液。4℃保存。配制含某種氨基酸的單缺或雙缺培養(yǎng)基時(shí)，在三缺型SD培養(yǎng)基中按1∶100 的比例加入100×的相應(yīng)氨基酸母液即可。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，在SD 培養(yǎng)基中再加入20 g 的瓊脂粉即可。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.2 方法

1.2.1CnVS基因的獲取及擴(kuò)增 通過查閱文獻(xiàn)，本研究選取了來源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶CnVS（Valencene synthase fromCallitropsis nootkatensis） 進(jìn)行異源表達(dá)，并從NCBI 基因庫上下載獲得CnVS基因序列（JX040471），將序列交由生工生物工程（上海）有限公司經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成。以含有CnVS基因的合成質(zhì)粒pUC57-VS 為模板，用引物對(duì)VS-F、VS-R 擴(kuò)增出CnVS基因片段，在片段兩端引入酶切位點(diǎn)SacI、BamH I、XbaI 和SmaI。將擴(kuò)增后得到的基因片段用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小檢測(cè)，然后再用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒Cycle-Pure Kit 純化基因片段，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因片段的濃度。實(shí)驗(yàn)所需引物如表3 所示。

1.2.2 不同CnVS表達(dá)載體的構(gòu)建 基于課題組前期構(gòu)建的表達(dá)載體YEplac181-PTDH3-TADH1和YEp352-PTDH3-TADH1，用BamH I 和SmaI 分別雙酶切兩個(gè)載體及PCR 擴(kuò)增得到的CnVS基因片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及試劑盒純化后，按照基因片段∶載體片段=6∶1（n∶n）的比例配制連接體系，兩個(gè)DNA 片段總質(zhì)量不可以超過150 ng，反應(yīng)總體系為10 μL。16℃過夜連接后，利用化學(xué)法轉(zhuǎn)化入E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過colony PCR 驗(yàn)證后，成功得到表達(dá)載體YEplac181-PTDH3-VS-TADH1、YEp352-PTDH3-VS-TADH1。

基于課題組前期構(gòu)建的表達(dá)載體YEplac181-TADH1-PTDH3-PTEF1-TCYC1，分 別 以cas1-F/181-bone-R 和181-bone-2-F/181-bone-2-R 為引物對(duì)，進(jìn)行片段PCR擴(kuò)增并得到兩條片段backbone-1 和backbone-2，同時(shí)以質(zhì)粒pUC57-VS 為模板，用引物對(duì)ADH1-VSF/TDH3-VS-R 和TEF1-VS-F/CYC1-VS-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到兩條片段VS-1 和VS-2。經(jīng)過上述PCR 反應(yīng) 共 得 到4 個(gè)DNA 片 段backbone-1、backbone-2、VS-1 和VS-2， 利用多片段同源重組試劑盒ClonExpress MultiS，將4 個(gè)片段連接在一起，并轉(zhuǎn)入E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，最終成功獲得雙向表達(dá)載體YEplac181-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1，用同樣的方法獲得雙向表達(dá)載體YE352-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1，構(gòu)建示意圖如圖1 所示。

1.2.3 基因敲除菌株的構(gòu)建 首先從NCBI 的基因數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）中 下載獲得S.cerevisiaeBJ5464 基因組上rox1基因的外顯子序列和erg9啟動(dòng)子序列。然后利用CRISPy 工具（http：//staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy_cenpk/），獲得上面2 個(gè)目的基因的所有潛在靶序列。根據(jù)CRISPy 的結(jié)果排序，選擇不會(huì)與其他基因位點(diǎn)產(chǎn)生特異性匹配的序列作為gRNA 的靶序列。

表3 本實(shí)驗(yàn)所用引物

gRNA 表達(dá)載體是基于購(gòu)自Addgene 公司的p426-PSNR52-gRNA.CAN1.Y-TSUP4（簡(jiǎn)稱P426）進(jìn)行構(gòu)建，采取同源重組的方法。首先根據(jù)質(zhì)粒P426 的序列信息，選取質(zhì)粒上的一段序列作為構(gòu)建2 個(gè)gRNA表達(dá)載體時(shí)的通用引物（Tong-F/R），然后以質(zhì)粒上原有的gRNA 靶序列前后的序列作為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)上下游引物，并將rox1和erg9基因靶序列分別添加到上下游引物的5′端，形成20 bp 的同源臂，通過同源臂重組作用獲得2 個(gè)單基因敲除的gRNA 表達(dá)質(zhì)粒P426-rox1、P426-erg9（圖2）。

圖1 雙向表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

圖2 gRNA 表達(dá)質(zhì)粒示意圖

利 用 酵 母 轉(zhuǎn) 化 試 劑 盒S.c.EasyComp Transformation Kit，將Cas9 蛋白表達(dá)質(zhì)粒（p414-PTEF1-Cas9-TCYC1，簡(jiǎn)稱p414-Cas9）轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeBJ5464 的感受態(tài)細(xì)胞中，最終得到可表達(dá)Cas9 蛋白的酵母菌株BJVC。隨后制備酵母菌株BJVC 的感受態(tài)細(xì)胞，將500 ng gRNA 表達(dá)質(zhì)粒和500 ng 對(duì)應(yīng)的用于DNA 修復(fù)的同源DNA 模板共同轉(zhuǎn)化到該可表達(dá)Cas9 蛋白的感受態(tài)細(xì)胞中，重組酵母細(xì)胞放在營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板SD/ΔUra-ΔTrp 中生長(zhǎng)，30℃培養(yǎng)2-4 d。經(jīng)過酵母菌落PCR 及基因測(cè)序驗(yàn)證，最終成功得到基因敲除菌株。

1.2.4 重組菌株雙相搖瓶發(fā)酵 挑取上述構(gòu)建成功的重組菌株，在對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的SD 液體培養(yǎng)基中30℃，220 r/min 培養(yǎng)36-72 h，直至OD600值為1-3，然后取適量菌液加到50 mL 錐形瓶中，并在錐形瓶中加入10 mL 相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的SD 液體培養(yǎng)基，使得錐形瓶中菌液起始OD600為0.05，加入2 mL 正十二烷覆蓋在菌液上方，用于萃取瓦倫西亞烯。發(fā)酵在30℃，220 r/min 環(huán)境下培養(yǎng)48 h。其中原始菌株作為對(duì)照組，各基因敲除菌株作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3 個(gè)平行樣。

探究不同碳源濃度時(shí)，設(shè)置3 個(gè)濃度梯度：20 g/L、80 g/L、140 g/L。探究不同氮源濃度時(shí)，設(shè)置了3 個(gè)濃度梯度N0、N1、N2，并設(shè)置一組將有機(jī)氮源替換成無機(jī)氮源的實(shí)驗(yàn)，如表4 所示。

1.2.5 瓦倫西亞烯的鑒定及產(chǎn)量檢測(cè) 氣相樣品制備：發(fā)酵48 h 結(jié)束后，取出50 mL 錐形瓶，靜置數(shù)分鐘直至有機(jī)相與水相分離開，用移液槍吸取上層的有機(jī)相至2 mL 離心管中，14000 r/min 離心5 min。然后取500 μL 上層有機(jī)相至1.5 mL 離心管中，并加入500 μL 乙酸乙酯和2 μL 異長(zhǎng)葉烯（作為內(nèi)參，終濃度為50 μmol/L），再加入適量無水硫酸鈉（吸水劑），充分振蕩混勻后，14000 r/min 離心5 min。用注射器吸取離心管的上層有機(jī)相，經(jīng)0.22 μm 無菌濾頭過濾至氣相色譜瓶中，-20℃凍存，作為GC檢測(cè)的樣品。

瓦倫西亞烯標(biāo)樣制備：為制作瓦倫西亞烯標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備濃度梯度為10、25、50、75、100/（mmol/L）的瓦倫西亞烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備方法同上。

GC-FID 檢測(cè)：用氣相色譜儀7890A 對(duì)制備的樣品及標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜柱為Agilent HP-5（30 m×0.32 mm；0.25 μm），使用氮?dú)庾鳛檩d氣。檢測(cè)方法為100℃保持10 min，然后以10℃/min 的速度勻速升溫至200℃并保持8 min，結(jié)束方法。

1.2.6 發(fā)酵液水相產(chǎn)物的鑒定及含量檢測(cè) 液相樣品制備：每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，從搖瓶中取出適量下層發(fā)酵液，14000 r/min 離心5 min，取950 μL 上清到1.5 mL 離心管中，并加入950 μL 超純水和100 μL 10%烯硫酸，充分振蕩混勻后，用0.22 μm 無菌濾頭過濾至液相色譜瓶中，-20℃凍存，作為HPLC 檢測(cè)的樣品。

標(biāo)樣制備：為制作葡萄糖和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別制備濃度梯度為2、4、6、8、10 g/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，和1、2、3、4、5 g/L 的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備方法同上。

HPLC 檢測(cè)：本研究使用高效液相色譜儀2695-2414 對(duì)制備的樣品及標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜柱為AMINEX HPX-87H（300 mm×7.8 mm），使用2.5 mmol/L 的稀硫酸作為流動(dòng)相。跑樣程序保持60℃，流動(dòng)相速率為0.6 mL/min，分析時(shí)間為25 min。

表4 氮源濃度梯度

2 結(jié)果

2.1 雙CnVS表達(dá)盒的酵母基因組整合

為構(gòu)建產(chǎn)瓦倫西亞烯釀酒酵母菌株，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將雙CnVS表達(dá)盒（TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1）整合到酵母基因組的rox1基因位點(diǎn)上，獲得該菌株BJV00 后，選取10 個(gè)單菌落進(jìn)行酵母菌落PCR，擴(kuò)增靶基因片段進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證雙CnVS表達(dá)盒整合效果。圖3 為雙CnVS表達(dá)盒整合基因組的菌落PCR 結(jié)果，從圖中看到3 號(hào)單菌落在rox1位點(diǎn)可擴(kuò)增出兩個(gè)CnVS表達(dá)盒的片段，基因測(cè)序結(jié)果也正確，說明成功將雙CnVS表達(dá)盒整合到酵母基因組上。

圖3 雙CnVS 表達(dá)盒整合的酵母菌落PCR 結(jié)果

2.2 瓦倫西亞烯產(chǎn)量與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

成功實(shí)現(xiàn)rox1基因的敲除并將雙CnVS表達(dá)盒整合到rox1位點(diǎn)后，獲得可合成瓦倫西亞烯的出發(fā)菌株BJV00，挑取該菌株的單克隆接種進(jìn)行雙相搖瓶發(fā)酵，探究瓦倫西亞烯產(chǎn)量變化與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的關(guān)聯(lián)，結(jié)果如圖4 所示。從圖中可看出，瓦倫西亞烯的增長(zhǎng)曲線與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本保持一致，最高達(dá)到4.16 mg/L，而在14 h 葡萄糖被消耗完后細(xì)胞增長(zhǎng)開始變緩，同時(shí)瓦倫西亞烯的增長(zhǎng)也變緩，說明瓦倫西亞烯的合成是生長(zhǎng)偶聯(lián)型。從乙醇曲線和甘油曲線可以發(fā)現(xiàn)在葡萄糖未消耗完前，兩者均是處于不斷積累的狀態(tài)，當(dāng)葡萄糖消耗完后，兩者含量開始下降，說明細(xì)胞開始消耗乙醇及甘油進(jìn)行生長(zhǎng)和瓦倫西亞烯合成。

2.3 erg9基因下調(diào)對(duì)瓦倫西亞烯產(chǎn)量的影響

在BJV00 菌株基礎(chǔ)上，我們引入對(duì)erg9基因的下調(diào)，在獲得基因敲除酵母菌株后，同樣選取10 個(gè)單菌落進(jìn)行酵母菌落PCR，擴(kuò)增靶基因片段進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證各基因敲除效果。圖5 為基因敲除↓erg9的酵母菌落PCR 結(jié)果，從圖中可看到各單菌落均擴(kuò)增出了條帶單一的目的條帶，挑取1-3 對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物直接送測(cè)，測(cè)序結(jié)果顯示均為陽性，即成功對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)修飾，獲得菌株BJV01，基因測(cè)序結(jié)果如圖6 所示。

圖4 瓦倫西亞烯與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖5 轉(zhuǎn)化子酵母菌落PCR 結(jié)果

挑取菌株BJV01 單菌落接種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖7 所示，對(duì)erg9基因下調(diào)后，菌體生長(zhǎng)與原始菌株保持一致，并未有明顯影響，而產(chǎn)量比原始菌株提高了約1.7 倍，達(dá)到了6.63 mg/L，表明erg9基因的下調(diào)對(duì)瓦倫西亞烯產(chǎn)量起到促進(jìn)作用。

2.4 不同碳氮源濃度對(duì)瓦倫西亞稀產(chǎn)量的影響

圖6 基因敲除的測(cè)序結(jié)果圖

基于BJV01 菌株，對(duì)培養(yǎng)基的碳氮源濃度進(jìn)行探究。碳源濃度選取了20 g/L、80 g/L、140 g/L 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖8 所示，初始糖濃度越高，菌體生長(zhǎng)量也越高，80 g/L 糖濃度的產(chǎn)量最高，達(dá)到8.1 mg/L，提高了約1.3 倍，而在此細(xì)胞產(chǎn)量上，20 g/L糖濃度與80 g/L 糖濃度一致，高于140 g/L 糖濃度。氮源濃度設(shè)置參考1.2.4，發(fā)酵結(jié)果如圖9 所示，提高氮源濃度同樣可以提高菌體生長(zhǎng)量，最高的N2 組達(dá)到33，而S 組中將氮源里的蛋白胨替換成無機(jī)氮源硫酸銨后，菌體生長(zhǎng)量大幅下降，僅有8.45。N1組的產(chǎn)量最高，達(dá)到11.74 mg/L，比N0 組提高了約1.3 倍，而在比細(xì)胞產(chǎn)量上卻是S 組最高，遠(yuǎn)高于另外3 組。

圖7 基因敲除菌株發(fā)酵結(jié)果

圖8 不同碳源濃度發(fā)酵結(jié)果

圖9 不同氮源濃度發(fā)酵結(jié)果

2.5 不同CnVS表達(dá)載體的構(gòu)建

以YEplac181-PTDH3-VS-TADH1為例，在得到陽性克隆轉(zhuǎn)化子后，挑取單菌落接種培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。如圖10 所示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到線性YEplac181 片段和CnVS基因片段，大小值分別為約6500 bp 和1800 bp 左右，均與理論值相符，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒YEplac181-PTDH3-VS-TADH1，同理驗(yàn)證重組表達(dá)載體YEplac352-PTDH3-VS-TADH1，測(cè)序結(jié)果正確，均構(gòu)建成功。

雙向表達(dá)載體以YEplac181-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1為例，VS-1 和VS-2 基因片段是以pUC57-VS 為模板PCR 擴(kuò)增得到，backbone-1 和backbone-2片段是以YEplac181-TADH1-PTDH3-PTEF1-TCYC1為模板PCR 擴(kuò)增得到，圖11-A 為4 個(gè)片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，從結(jié)果可看出每個(gè)片段均得到單一的目的條帶，大小也符合理論值。片段通過同源重組連接在一起后，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖11-B 所示，大小符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果正確。

2.6 不同表達(dá)載體對(duì)瓦倫西亞烯產(chǎn)量的影響

基于載體YEplac181 和YEp352 構(gòu)建了不同CnVS表 達(dá) 載 體p181-VS、p352-VS、p181-2VS、p352-2VS，并導(dǎo)入釀酒酵母BJ5464 體內(nèi)得到菌株BJV02、BJV03、BJV04、BJV05， 發(fā) 酵 結(jié) 果 如圖12 所示，結(jié)果表明在只含單CnVS表達(dá)盒的情況下，BJV03 產(chǎn)量是BJV02 產(chǎn)量的2.35 倍，增加一個(gè)CnVS表達(dá)盒后，BJV04 比BJV02 提高了約2.5 倍，但BJV05 相比BJV03 并沒有明顯提高。且在含雙CnVS表達(dá)盒時(shí)，BJV04 和BJV05 并無明顯差距。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量，將最優(yōu)表達(dá)載體p181-2VS 轉(zhuǎn)入雙基因敲除菌株BJV06（↓erg9Δrox1）中，獲得菌株BJV07，經(jīng)過發(fā)酵最終獲得17.54 mg/L 的產(chǎn)量，比雙CnVS表達(dá)盒在酵母基因組上的BJV01 提高了2.6 倍。

圖10 重組表達(dá)載體酶切驗(yàn)證結(jié)果

圖11 雙向表達(dá)載體片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本研究通過在釀酒酵母BJ5464 體內(nèi)引入來自植物黃扁柏的CnVS基因，并將兩個(gè)CnVS表達(dá)盒整合入酵母基因組的rox1位點(diǎn)上，使得酵母細(xì)胞能利用簡(jiǎn)單碳源合成瓦倫西亞烯，同時(shí)rox1位點(diǎn)的敲除也可以解除對(duì)MVA 途徑的抑制［10-11］，初始產(chǎn)量為4.16 mg/L。為進(jìn)一步提高產(chǎn)量，對(duì)麥角固醇合成途徑的關(guān)鍵基因erg9進(jìn)行下調(diào)，增加通往瓦倫西亞烯途徑的碳流量，發(fā)酵產(chǎn)量的提升證明erg9基因的下調(diào)對(duì)瓦倫西亞烯產(chǎn)量起到促進(jìn)作用，這也與已有文獻(xiàn)報(bào)道相符［7，12-15］，也說明下調(diào)或敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑的改造策略的有效性［16］。

探究不同碳氮源濃度對(duì)產(chǎn)量影響時(shí)，碳氮源濃度的提高均能提高細(xì)胞生長(zhǎng)積累，但產(chǎn)量卻并沒有與碳氮源濃度完全成正比，可能原因是碳氮源濃度過高時(shí)，菌體的生長(zhǎng)速率過快，代謝能量均用于細(xì)胞生長(zhǎng)，而并未用于瓦倫西亞稀的合成，所以碳氮源濃度提高對(duì)產(chǎn)量的提升作用并不明顯，這可能也是隨著碳氮源濃度提高，比細(xì)胞產(chǎn)量反而下降的原因。另外也說明雖然瓦倫西亞稀的合成是生長(zhǎng)偶聯(lián)型，但并非菌體生長(zhǎng)積累越高，瓦倫西亞稀產(chǎn)量越高，而是需要將細(xì)胞生長(zhǎng)速率與產(chǎn)物合成速率控制在一定比值范圍內(nèi)，這也是后續(xù)需要進(jìn)一步探究的。還有研究表明細(xì)胞體內(nèi)氧化還原失衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致代謝流溢出，流向乙醇甘油等副產(chǎn)品的合成，造成能量的損失，不利于目的產(chǎn)物的積累［17-18］，控制低糖濃度發(fā)酵有利于減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，因而發(fā)酵培養(yǎng)基有待進(jìn)一步優(yōu)化。

在不同CnVS表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)中，單CnVS表達(dá)盒的情況下，YEp352 載體的表現(xiàn)要優(yōu)于YEplac181載體，說明不同載體也會(huì)對(duì)瓦倫西亞烯產(chǎn)量造成影響，可能原因一是YEp352 載體拷貝數(shù)要高于YEplac181，提高了整體的酶活，后續(xù)可以通過檢測(cè)兩者的拷貝數(shù)來進(jìn)行驗(yàn)證；二是YEp352 載體上的某部分元件促進(jìn)CnVS的表達(dá)，從而提高了瓦倫西亞烯產(chǎn)量，這仍有待繼續(xù)探究。另外在同樣的基因敲除背景下，CnVS表達(dá)盒在質(zhì)粒上時(shí)的瓦倫西亞烯產(chǎn)量要遠(yuǎn)優(yōu)于CnVS表達(dá)盒整合到基因組上的產(chǎn)量，猜測(cè)是基因組上CnVS基因拷貝數(shù)較低，導(dǎo)致酶活較低的原因［19-20］，因而提高CnVS基因的拷貝數(shù)是進(jìn)一步提高產(chǎn)量的關(guān)鍵［21-23］。

圖12 含不同CnVS 表達(dá)載體菌株的發(fā)酵結(jié)果

4 結(jié)論

本研究基于釀酒酵母菌株BJ5464，引入瓦倫西亞烯合成酶，并結(jié)合代謝途徑改造、培養(yǎng)基優(yōu)化以及表達(dá)載體適配性等策略，最終獲得最高產(chǎn)量為17.54 mg/L 的酵母工程菌株，比出發(fā)菌株提高了約4.2倍，對(duì)利用其他微生物表達(dá)高價(jià)值化合物具有重要參考意義。