解淀粉芽孢桿菌相關功能機制研究進展

王世偉 王卿惠

（1. 齊齊哈爾大學生命與農(nóng)林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，齊齊哈爾 161005；2. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬革蘭氏陽性菌，有很多桿菌屬沒有的特性，如孢子和生物膜形成、定殖和促生產(chǎn)生揮發(fā)物，降解有毒物，提高植物對非生物脅迫耐受性等。了解解淀粉芽孢桿菌特性，揭示其重要機理具有重要意義。本文對解淀粉芽孢桿菌具有的重要功能和產(chǎn)生的相關機理進行了歸納和總結，旨為更好的應用解淀粉芽孢桿菌提供科學數(shù)據(jù)。

1 解淀粉芽孢桿菌芽孢形成與滅活機制

1.1 解淀粉芽孢桿菌影響芽孢形成的因素

優(yōu)化培養(yǎng)基成分能提高解淀粉芽孢桿菌的孢子形成能力，產(chǎn)孢基因共表達網(wǎng)絡（GCNs）模型是探索孢子形成規(guī)律的一種新方法。Ren 等［1］優(yōu)化了淀粉芽孢桿菌BS-20 產(chǎn)孢培養(yǎng)基，利用響應面法（RSM）確定Mn2+、Fe2+和Ca2+最佳濃度，使孢子產(chǎn)量增加3.4倍；補充最佳濃度的豆粕和玉米粉，可使其孢子產(chǎn)量增加8.8 倍?？梢?，不同離子濃度和培養(yǎng)基氮源和碳源對其孢子形成都有影響。Berikashvili 等［2］使用木質纖維素固態(tài)發(fā)酵對解淀粉芽孢桿菌B-1895 生長和孢子形成情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)使用玉米芯能提高孢子產(chǎn)量，用60 mL 優(yōu)化營養(yǎng)培養(yǎng)基（每升含10 g 蛋 白 胨、2 g KH2PO4、1 g MgSO4·7H2O 和1 g NaCl）潤濕15 g 玉米芯，能獲得最大孢子產(chǎn)量。利用解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌孢子形成差異可探索解淀粉芽孢桿菌孢子形成規(guī)律。Omony 等［3］重建并比較了枯草芽孢桿菌168 和解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)孢基因共表達網(wǎng)絡模型，利用孢子形成6 階段的樣本轉錄組數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡推理，并進行基因集富集分析（GSEA），在生物學功能方面比較兩菌株的GCNs的差異發(fā)現(xiàn)了與孢子形成相關的功能基因組富集模塊。根據(jù)GCNs 和差異表達基因的時間演化，鑒定出與枯草芽孢桿菌168 和解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)孢密切相關的新候選基因。GCNs 為探索轉錄因子及其靶點以及孢子形成過程中共表達基因提供了一個框架?？梢?，解淀粉芽孢桿菌孢子形成可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分加以提高，孢子形成規(guī)律可以通過比較不同菌種孢子形成相關基因，尋找候選基因加以研究。

1.2 解淀粉芽孢桿菌芽孢存活和滅活機制

研究解淀粉芽孢桿菌的孢子形成、存活具有理論和實踐意義。礦物質和溫度對解淀粉芽孢桿菌存活率具有明顯影響。Shahrokh Esfahani 等［4］用水和鹽水以及碳酸鈣、磷酸鈣和二氧化硅等不同礦物質，檢測解淀粉芽孢桿菌存活和保存情況。結果表明，8℃時靜息細胞死亡較嚴重，1 個月后28℃時存活較明顯。然而，在兩種溫度下，礦物質保存顯著誘導孢子形成，降低了死亡率。在磷酸三鈣存在下，靜息細胞在室溫維持一個月后，約60%初始群體仍然存活。與饑餓相比，溫度對孢子形成影響更大。28℃生理鹽水中的產(chǎn)孢量是8℃時的70 倍，加入磷酸三鈣使產(chǎn)孢量增加90 倍。FTIR 數(shù)據(jù)顯示磷酸三鈣能同孢子和休眠細胞發(fā)生相互作用。用噻唑橙核酸（Thiazole orange）染色，流式細胞術研究證實，在28℃時，使用磷酸三鈣的情況，孢子形成率明顯高于純水。同樣，對解淀粉芽孢桿菌孢子滅活機制的探討也具有重要意義。Huang 等［5］利用環(huán)境空氣非熱等離子體（NTP-AA）對解淀粉芽孢桿菌孢子滅活機理進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)NTP-AA 對孢子滅活不存在內(nèi)在的D 值（即滅活90%孢子所需的時間），而成非線性（雙相）滅活動力學模式；滅活率取決于初始孢子濃度和孢子所暴露的活性物質。在NTPAA 中加入適量水，可以加速孢子滅活。說明NTPAA 在孢子表面侵蝕是逐漸進行的，伴隨著孢子的生化損傷，包括結構蛋白、內(nèi)部脂質的改變和孢子核二萜酸類含量的損失，是滅活的主要機制。有證據(jù)表明，NTP-AA 對孢子表面的侵蝕是導致孢子核失活的主要原因。NTP-AA 能穿透皮層，到達孢子核心部位造成孢子損害。

2 解淀粉芽孢桿菌生物膜形成因素與相關機理的研究

生物膜（Biofilm）是被細菌胞外大分子包裹的細菌群體。生物膜細菌對抗生素具有很強抗性，并使宿主獲得免疫防御機制。生物膜多細胞結構的形成是一個動態(tài)過程，包括細菌起始黏附、生物膜發(fā)展、成熟和擴散等階段。為了使解淀粉芽孢桿菌在各相關領域得以應用，有必要進一步分析菌種的特性，揭示生物膜形成規(guī)律。

2.1 植物提取物對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成的影響

解淀粉芽孢桿菌與植物之間存在多種互惠互利關系。植物提取物也影響菌種的生物膜形成；反過來解淀粉芽孢桿菌生物膜形成又能增強植物對病原菌的抵抗力。植物提取物中碳水化合物能提高解淀粉芽孢桿菌生物膜形成能力。Wu 等［6］發(fā)現(xiàn)植物提取物影響解淀粉芽孢桿菌SQY 162 趨化性和生物膜形成。所有測試碳水化合物都能誘導該菌株趨化性和生物膜形成。果膠能通過表面活性素合成以及生物膜形成相關基因轉錄表達，誘導解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生趨化反應并有助于生物膜形成。盆栽試驗中，隨著蔗糖或果膠添加，根際表觀蛋白產(chǎn)量和SQY162數(shù)量顯著增加，而細菌性病原菌（青枯菌）數(shù)量則減少。果膠處理后，隨著SQY162 在煙草根際次生代謝物產(chǎn)量增加，SQY162 定殖密度迅速提高，從而有效地抑制青枯病發(fā)病率。某些植物提取物可作為SQY162 能源或環(huán)境線索，提高煙草根部種群密度和生物防治煙草青枯病的效果。

2.2 種子滲出物對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成的影響

種子滲出物對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成也有影響。Martins 等［7］研究了蠶豆種子滲出物對菌株ALB629 生物膜形成、細菌體外生長，以及干旱脅迫下對菌株和植物相關變量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，種子滲出液能增加ALB629 菌株生物膜形成，從而誘導植物對干旱產(chǎn)生抗性。在培養(yǎng)基和大豆種子表面ALB629 菌落形成單位均有所增加。深入研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子滲出物能使ALB629 菌株Tas和EpsD基因表達分別上調約2 和6 倍。經(jīng)ALB629 和蘋果酸（種子分泌物）改良處理種子，其幼苗具有較高細菌濃度，能促進植物生長，誘導植物抗旱性。

2.3 植物根系分泌物對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成的影響

植物分泌物對解淀粉芽孢桿菌的生物膜形成也有影響。解淀粉芽孢桿菌SQR9 是一種促進植物生長的根桿菌（PGPRs），它在植物根部形成生物膜，保護植物免受多種病原體的侵害。Kimani 等［8］報道了黃瓜根分泌物在不同發(fā)育階段對SQR9 生物膜基質生化組成的影響。結果表明，黃瓜根系分泌物中的氨基酸是引起SQR9 生物膜形成的主要原因。以黃瓜不同生長階段根系分泌物為碳源，進行生物膜形成測試，結果發(fā)現(xiàn)生物膜基質在數(shù)量上和質量上都存在差異。由共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM54211）觀察到生物膜基質主要由氨基酸組成，其形成的蛋白質是形成胞外聚合物（EPS）的主要成分。由此可見，利用氨基酸為基礎的膳食補充劑來控制植物中生物膜的形成是一個可行的方案。Yuan 等［9］采用高壓液相色譜法對香蕉根分泌物進行分析，結果表明，香蕉根分泌物中含有草酸、蘋果酸和富馬酸等多種有機酸。研究了解淀粉芽孢桿菌NJN-6 對香蕉根分泌物中有機酸（OAs）的趨化性和生物膜形成的響應。通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qrt-PCR）評價了參與生物膜形成的基因yqxM、epsDYQXM和EPSD對有機酸的反應水平。結果表明，含有有機酸的根系分泌物均能誘導NJN-6 趨化性和生物膜形成。蘋果酸使菌株表現(xiàn)出最大趨化反應，而富馬酸顯著地誘導生物膜形成，增加生物膜形成基因表達?？梢?，香蕉根系分泌物，尤其是釋放的有機酸，在吸引和啟動PGPR 在宿主根系上定殖起著關鍵作用。玉米根系分泌物主要通過促進細胞生長和誘導細胞外基質產(chǎn)生促進生物膜形成。Zhang 等［10］研究發(fā)現(xiàn)玉米根系分泌物刺激液體培養(yǎng)基中SQR9 生物膜形成，這與根系定殖增強呈正相關。在靜態(tài)條件下，通過SQR9 的RNA 測序進行的轉錄譜分析表明，接種后24 h 根系分泌物刺激代謝相關基因表達，而48 h 后能激活產(chǎn)生細胞外基質的相關基因。其分泌物中刺激生物膜形成的個別成分包括葡萄糖、檸檬酸和富馬酸反丁烯二酸，它們能促進SQR9 細胞生長或激活細胞外基質產(chǎn)生。此外，在SQR9 基因中還發(fā)現(xiàn)與根際適應和植物有益性狀有關基因，其中包括植物多糖利用、細胞運動性和趨化性、次級抗生素合成和植物生長促進的相關基因，這些基因似乎也是由玉米根分泌物誘導的?？梢?，根系分泌物有重要的功能，能刺激解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生生物膜，促進菌體在植物上定殖，最終促進植物生長。

2.4 解淀粉芽孢桿菌的生物膜形成的調節(jié)和功能機制

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種信號分子、多功能二級信使以及化合物對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成具有調節(jié)作用。一氧化氮（NO）是植物根際區(qū)域重要信號分子。Dong 等［11］發(fā)現(xiàn)外源低濃度NO 能提高解淀粉芽孢桿菌SQR9 生物膜形成能力，而高濃度NO 則抑制該菌株生長。SQR9 菌株yflM基因編碼一氧化氮合酶（NOS），用于一氧化氮合成；而ykvO基因編碼墨喋呤還原酶，用于四氫生物蝶呤（NOS 的輔酶）合成。YkvO和NADPH 之間存在相互作用。SQR9 有兩個hmp基因，其中只有一個通過氧化負責NO 解毒。雙（3′→5′）環(huán)二聚鳥苷一磷酸（c-di-GMP）被認為是一種細菌高度通用多功能二級信使，協(xié)調細菌生長、運動和生物膜形成。解淀粉芽孢桿菌PG12是蘋果環(huán)腐病生物防治劑。Yang 等［12］研究了PG12的c-di-GMP 轉換的核心調節(jié)因子，鑒定了2 種活性雙鳥苷酸環(huán)化酶（YhcK 和YtrP），催化c-di-GMP 生物合成，以及一種能降解c-di-GMP 活性的c-di-GMP磷酸二酯酶（YuxH）。當c-di-GMP 提高到臨界值時，即可抑制PG12 游動。雖然yhcK、ytrP和uxH基因敲除突變體在生物膜形成過程中沒有顯示缺陷，但YtrP或YuxH過表達能誘導c-di-GMP 水平顯著增加，從而刺激菌體生物膜形成。二酮哌嗪（DKPS）對生物膜形成具有抑制作用。Wang 等［13］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Q-426 菌株產(chǎn)生的二酮哌嗪能抑制氣液界面形成的生物膜。從解淀粉芽孢桿菌Q-426 中提取4種二酮哌嗪類（DKPs）發(fā)現(xiàn)，0.04 mg/mL 的DKPs對菌株的生物膜形成有明顯的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌Q-426 產(chǎn)生的DKPs 對胞外聚合物（EPS）成分、多糖、蛋白質、DNAs 等有明顯降低作用，通過實時PCR 檢測DKPs 對生物膜形成相關基因表達水平。研究發(fā)現(xiàn)與蛋白質、細胞外基質和多糖相關基因（tasA、epsH、epsG和remB）相對表達水平下調；而核酸酶基因nuc表達水平顯著上調。這些基因mRNA 表達水平定量結果，與EPS 水平定量結果一致?？梢?，DKPS 能抑制解淀粉芽孢桿菌Q-426 生物膜形成。DegU 逐步磷酸化能影響解淀粉芽孢桿菌生物膜形成。Xu 等［14］從黃瓜根圈中分離淀解淀粉芽孢桿菌SQR9，能抑制黃瓜根圈中尖孢鐮刀霉的生長，又能有效根殖主干保護植物免受病原體入侵。在革蘭氏陽性桿菌中，反應調節(jié)器DegU 能調節(jié)遺傳能力，蒸發(fā)動力，生物膜形成，復合菌落結構和蛋白酶生產(chǎn)。DegU 逐步磷酸化，可以通過協(xié)調多細胞行為和調節(jié)抗生素合成，影響生物控制活性。體外和原位實驗及定量PCR 研究表明：（1）磷酸化degu（degu ～p）最低水平損害鐮刀菌枯萎病復雜菌落結構，減弱其生物膜形成能力，降低其定殖活動和生物控制效率，但增加了大內(nèi)酰胺和桿菌烯產(chǎn)生；（2）degQ 和degSU 過度表達能增加 DegU～P 水平，顯著改善復雜菌落結構，增強生物膜形成、定殖活性以及抗生素bacillomycin d 和difficidin 產(chǎn)生，提高鐮刀菌枯萎病的生物防治效率?？梢姡獾矸垩挎邨U菌生物膜形成和調節(jié)規(guī)律的揭示不僅能闡明植物生長促進因素和機制，而且對提高植物對病原微生物抗性具有重要價值。

3 解淀粉芽孢桿菌定殖問題及產(chǎn)生機制

3.1 解淀粉芽孢桿菌定殖于植物的方法和部位研究

某些解淀粉芽孢桿菌菌株可以在植物上定殖，改善其生長和脅迫管理。為了研究細菌在植物和根際的生長動態(tài)，需要特定分析方法。Johansson 等［15］建立了定量實時聚合酶鏈反應分析方法，以區(qū)分3 種密切相關解淀粉芽孢桿菌亞群（UCMB5033、UCMB5036、UCMB5113）及其含量，測定具有較高的準確性。寡核苷酸引物設計用于菌株獨特的基因序列，并用于基于熒光結合染料（SYBR Green I）qPCR 分析。標準曲線涵蓋了DNA 量的寬線性范圍（106），最低檢測水平為50 fg。反應后熔融曲線分析顯示只有一個產(chǎn)物。即使存在大量相關芽孢桿菌菌株和土壤中細菌總DNA，也能獲得準確臨界值周期。對兩個油籽油菜品種（Oase 和Ritz）在瓊脂載體上進行種子處理后的芽孢桿菌定殖分析表明，細菌主要存在于根組織，很少存在于綠色組織。生長在土壤中的不同芽孢桿菌菌株在植物中定殖情況各不相同，在這些菌株中，Oase 似乎比Ritz 含有更多細菌。3 個芽孢桿菌菌株作為混合物，均存在于土壤中生長的植物根系上。

3.2 根系分泌物對解淀粉芽孢桿菌定殖的影響

根系分泌物在根際土壤微生物相互作用中起著重要作用，能介導根際有益微生物-植物-病原菌的三方相互作用。Liu 等［16］為了研究分泌物中有機酸組分在這一過程中的作用，以黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucucumerinum J.H.Owen，F(xiàn)OC）為感染源，研究了促進植物生長的根桿菌解淀粉芽孢桿菌SQR9 對黃瓜根的定殖作用。分析SQR9 對根系分泌物及其有機酸組分的趨化性和生物膜形成。黃瓜FOC 感染對SQR9 根定植的影響是對照組的3.30 倍。FOC 感染后黃瓜植株檸檬酸和富馬酸的根系分泌增強，同時淀粉樣芽孢桿菌SQR9 對FOC 感染黃瓜幼苗根系分泌物的趨化性增強。檸檬酸是一種化學引誘劑，富馬酸是生物膜形成的刺激劑。這些結果表明，根系分泌物介導了黃瓜根系與根際菌株解淀粉芽孢桿菌SQR9 的相互作用，增強了后者在根部的定殖。

3.3 解淀粉芽孢桿菌定殖相關基因和因子的研究

研究相關基因的突變能為解淀粉芽孢桿菌定殖機理闡明提供科學數(shù)據(jù)。Weng 等［17］對淀粉樣芽孢桿菌SQR9 的AbrB基因進行了突變，研究發(fā)現(xiàn)AbrB基因受到破壞，可以顯著提高SQR9 定殖和生控活性。PGPR 根際趨化遷移和定殖是解淀粉芽孢桿菌的重要功能。趨化介導對根分泌物的反應，是通過甲基接受趨化蛋白（MCP）感應特定配體而引發(fā)的，系統(tǒng)地鑒定復合根分泌物中的化學引誘劑及其在PGPR 中的感受性化學受體，有助于促進其招募和定植的機制研究。Feng 等［18］從解淀芽孢桿菌SQR9的98 個根分泌物組分中，鑒定出39 種化學引誘劑和5 種化學排斥劑，包括氨基酸、有機酸和糖。突變菌株SQR9Δ8mcp，全部8 個假定的化學受體被完全刪除，失去了對這44 種化合物的趨化反應。基因互補、趨化性試驗、恒溫滴定量熱分析表明，McpA主要負責檢測有機酸和氨基酸，而McpC 主要負責氨基酸的檢測。這兩種化學受體可能在SQR9 根際趨化作用中發(fā)揮重要作用。相比之下，解淀粉芽孢桿菌獨特的化學受體McpR 對精氨酸具有特異性作用，而殘基Tyr-78、Thr-131 和Asp-162 對精氨酸結合至關重要?？梢姡瑢ο嚓P基因和受體因子的研究，能更好理解解淀粉芽孢桿菌定殖規(guī)律和調節(jié)機制。

4 解淀粉芽孢桿菌促生問題及作用機制

4.1 解淀粉芽孢桿菌對植物的促生作用

解淀粉芽孢桿菌對整個植株具有促生作用。Asari 等［19］報告了淀粉樣芽孢桿菌植物亞種UCMB5113，盡管抑制了初生根的伸長，但能通過增加側根的生長和伸長以及根毛的形成促進擬南芥Col-0 的生長。此外，該菌株還能刺激地上組織生長。檢測特異性激素報告基因株表明，在擬南芥根結構的根桿菌調控過程中，至少存在生長素和細胞分裂素信號的作用。該菌株能產(chǎn)生細胞分裂素和吲哚-3-乙酸，后者的形成受到根系分泌物和色氨酸的刺激。菌株對植物生長的促進作用與植物抗病作用相比，似乎不依賴茉莉酸。菌株滲出物抑制了初生根生長，而半純化的脂肽部分沒有抑制初生根生長，從而導致整體生長促進。表明許多不同細菌化合物相互作用，影響寄主植物根生長?？梢?，該菌株通過經(jīng)典和新穎的信號與植物根系發(fā)育相互作用。解淀粉芽孢桿菌對植物幼苗也具有促生作用。Qin 等［20］采用無需培養(yǎng)的測序方法，研究了解淀粉芽孢桿菌L-S60對杜林黃瓜根際微生物區(qū)組成、動態(tài)以及生長條件。結果表明，L-S60 施用顯著改變黃瓜幼苗相關細菌群落結構。L-S60 施用促進黃瓜幼苗生長條件，L-S60處理組黃瓜幼苗中有效礦物元素含量高于對照組。淀粉樣芽孢桿菌應用于棉花種子可以促進生長，改變根系結構，減輕棉花幼苗的鹽脅迫。

4.2 解淀粉芽孢桿菌對植物幼苗促生機制的研究

基因表達對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生促生特性影響十分重要。Irizarry 等［21］利用基因芯片芯片和RTqPCR 檢測了接種解淀粉芽孢桿菌幼苗根系中基因表達變化。用3′3-二氨基聯(lián)苯胺二氨聯(lián)苯和間苯二酚三酚-HCl 對根系進行染色，以確定處理后幼苗是否具有更大活性氧，活性物質種類和木質素累積量。接種后棉花幼苗根系中有252 個轉錄體差異表達，139 個轉錄體上調，113 個轉錄體下調。一些上調轉錄體與硝酸鹽同化、細胞生長、激素、轉運、轉錄因子和抗氧化劑有關，用RT-qPCR 檢測出5 個基因上調表達。接種后的棉花幼苗根系中，活性氧和木質素積累量較大，多種功能相關基因差異表達。這些現(xiàn)象的發(fā)生說明淀粉樣芽孢桿菌能引起幼苗根系發(fā)生復雜的遺傳反應。有研究表明，有益根桿菌促進植物生長機制包括色氨酸依賴性吲哚-3-乙酸（IAA）合成。然而，根際色氨酸豐度也可能影響根桿菌產(chǎn)IAA 效率和水平。Liu 等［22］檢測了黃瓜解淀粉芽孢桿菌SQR9 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，SQR9 使根部分泌色氨酸顯著增加。黃瓜色氨酸轉運基因表達明顯增強，但氨基苯甲酸鹽（或酯）合成基因表達無明顯變化。那些根際分泌物中單獨色氨酸的增加，就足以促進SQR9 分泌IAA 產(chǎn)量量的增加。此外，在裂根系統(tǒng)一個小室中，SQR9 定殖于根會導致其他根產(chǎn)生足夠色的氨酸，從而上調SQR9 菌株IAA 生物合成的基因表達。在根部的后續(xù)定殖過程中，吲哚-3-乙腈酶基因yhcX增加了27 倍。yhcX缺失消除的SQR9 能介導的根表面積增加，可能是通過減少IAA 來刺激側根的生長。解淀粉芽孢桿菌與植物黃瓜之間的化學信號的對話有助于細菌介導的植物生長促進作用。Fan 等［23］采用親和力富集和高分辨率LC-MS/MS 分析相結合方法，分析了解淀粉芽孢桿菌FZB42 賴氨酸丙二酰化問題，實驗共鑒定出382 個蛋白質中的809 個丙二酰賴氨酸位點。生物信息學分析表明，在參與多種生物功能（中心碳代謝、脂肪酸生物合成代謝和NAD（P）結合和翻譯機制）的蛋白質上，賴氨酸發(fā)生了丙二?；灰唤M已知的，與根桿菌-植物相互作用有關蛋白質也被丙二酰化；負責抗生素合成的酶，包括聚酮合酶（PKSs）和非核糖體肽合酶（NRPSs）被高度丙二?；??？梢?，在蛋白質結構上發(fā)生丙二酰化，對促進植物生長可能具有重要意義。

5 解淀粉芽孢桿菌揮發(fā)性物質特點和作用機理

5.1 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質及對植物的益生作用研究

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質對植物具有很多的有益作用。Asari 等［24］探討解淀粉芽孢桿菌UCMB5113 的揮發(fā)物（VOC）對植物生長促進和對病原菌的控制作用。通過對擬南芥（Arabidopsis thalianaCol-0）幼苗生長情況和對蕓苔屬真菌病原菌防治能力來篩選VOC 的實驗中，研究了不同菌株VOC 對擬南芥幼苗影響。4 種芽孢桿菌菌株揮發(fā)性有機化合物均能促進擬南芥植株生長，增加植株生物量，但其影響程度取決于所使用的培養(yǎng)基。以UCMB5113 菌株為例，通過利用MS 瓊脂培養(yǎng)基（含或不含根分泌物）的實驗表明，即使在低劑量水平分泌物也能顯著促進植物生長。解淀粉芽孢桿菌VOC 對幾種真菌病原菌的體外生長有拮抗作用，但不同菌株對植物生長的促進作用和真菌抑制作用不同。Gotor-Vila 等［25］研究了解淀粉芽孢桿菌CPA-8揮發(fā)性有機化合物（VOCs）對甜櫻桃果實采后3 種病 原 菌Monilinia laxa、M.fruiticola和Botrytis cinera的抑真菌作用。采用固相微萃?。⊿PME）氣相色譜法鑒定其主要揮發(fā)性化合物分別為1，3-戊二烯、3-羥基-2-丁酮和噻吩。研究發(fā)現(xiàn)噻吩能有效抑制病原菌菌絲生長。Raza 等［26］以3 種不同動植物廢棄物（BOFs）為有機肥原料，研究了解淀粉芽孢桿菌SQR-9 和T-5 兩種菌株所產(chǎn)生的抗菌VOC 對影響番茄的青枯病雷氏菌（Ralstonia solanacearum）的抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)它們都能抑制RS 生長和毒力。在存在植物廢料情況下，抗菌VOC 顯著增加。菌株T-5產(chǎn)生的2-壬酮2-壬酮2-壬酮、壬醛壬酮、二甲苯二甲基苯、苯并噻唑并壬酮和丁基羥基甲苯二甲基苯；菌株SQR-9 產(chǎn)生的2-壬酮、壬醛、二甲苯和2-十一烷甲基苯是主要的抗菌VOC，在BOFs 存在下其揮發(fā)物產(chǎn)量顯著增加。可見，解淀粉芽孢桿菌揮發(fā)性有機化合物對植物病原菌有很好的抑制作用，有機肥料對該菌揮發(fā)物的產(chǎn)生有增強作用，因此要重點研究。

5.2 解淀粉芽孢桿菌揮發(fā)物抑菌功能機制的研究

Raza 等［27］結果表明，T-5 菌株的揮發(fā)性有機化合物不僅在瓊脂培養(yǎng)基和土壤中均能顯著抑制青枯雷爾氏菌的生長，還顯著抑制青枯雷爾氏菌的運動特性、根系定植、生物膜形成以及抗氧化酶和胞外多糖的產(chǎn)生，然而對青枯雷爾氏菌水解酶的產(chǎn)生沒有影響。實時聚合酶鏈反應進一步證實了菌株T-5暴露后，在茄科植物細胞中不同毒力和代謝相關基因表達量降低。Raza 等［28］評估了解淀粉芽孢桿菌SQR-9 產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物（VOCs）對番茄枯萎病菌Ralstonia solanacearum（RS）生長和毒力特性的影響。SQR-9 揮發(fā)性有機化合物在瓊脂培養(yǎng)基和土壤中均能顯著抑制RS 生長。此外，VOCs 對RS 的運動特性、抗氧化酶和胞外多糖的產(chǎn)生、生物膜的形成和番茄根系的定殖都有明顯抑制作用，菌株SQR-9 產(chǎn)生了22 種VOCs，但只有9 種VOCs 在其相應程度上對RS 有抗菌活性（1%-11%）；然而，所有VOCs 組成的聯(lián)合體對RS 有70%抑制作用。蛋白質組學分析表明，SQR-9 的VOCs 使與抗氧化活性、毒力、碳水化合物和氨基酸代謝、蛋白質折疊和翻譯有關Rs 蛋白下調；而使參與ABC 轉運系統(tǒng)、氨基酸合成、醛酮類解毒、甲基化、蛋白質翻譯和折疊以及能量轉移有關蛋白上調。可見，解淀粉芽孢桿菌揮發(fā)物質具有重要的功能，研究其促生和抑菌機制，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有潛在的理論和應用價值。

6 解淀粉芽孢桿菌提高植物對非生物脅迫的耐受性研究

6.1 解淀粉芽孢桿菌提高植物對干旱的耐受性

由于固著性，植物必須承受各種不利環(huán)境壓力條件，包括生物和非生物壓力。相比之下，干旱、鹽分、高溫和寒冷等非生物脅迫對全球的植物生長和產(chǎn)量造成了負面影響，從而對農(nóng)業(yè)構成了重大威脅。解淀粉芽孢桿菌能改善非生物脅迫對植物產(chǎn)生的負面影響。兩種促進植物生長的根桿菌（PGPR）假單胞菌NBRIRA 和解淀粉芽孢桿菌NBRISN13 能夠使植物耐受非生物脅迫。Kumar 等［29］詳細闡述了在控制和干旱脅迫條件下，利用這2 種PGPR 組合提高鷹嘴豆促生的可能性和效益。體外實驗表明，這兩種PGPR 菌株都是相容的，它們的協(xié)同生長增強了PGPR 的特性。通過溫室試驗，評價了株系單獨接種和聯(lián)合經(jīng)營對耐旱鷹嘴豆敏感品種（BG362 和P1003）的影響，結果表明，與單個PGPR 相比，接種聯(lián)合體植物的生長參數(shù)明顯更高。用綠色熒光標記法觀察了兩種PGPR 在鷹嘴豆根際的定殖。除生長參數(shù)外，單獨接種PGPR 和聯(lián)合接種植物的防御酶、土壤酶和微生物多樣性均受到顯著的調控。在單獨或聯(lián)合使用PGPR 處理的鷹嘴豆品種中，較高的生物量以及脅迫指標的逆轉均說明已明顯改善了植物對干旱脅迫的負面效應。

6.2 解淀粉芽孢桿菌提高植物對鹽脅迫的耐受性

Chen 等［30］發(fā)現(xiàn)，PGPR 菌株解淀粉芽孢桿菌SQR9可幫助玉米植株抵御鹽脅迫。在鹽脅迫20 d后，與對照相比，SQR9 顯著促進玉米幼苗的生長，提高了葉綠素含量；進一步分析表明，提高總可溶性糖含量可降低植物細胞被破壞，提高過氧化物酶/過氧化氫酶/過氧化氫酶活性和谷胱甘肽谷甘肽含量可清除凈化活性氧物質，也可減少細胞被破壞，降低植物體內(nèi)鈉離子的毒性。SQR9 能通過保護植物細胞和管理Na（+）的動態(tài)平衡賦予植物耐鹽性。Shalini等［31］探討了在水溶液培養(yǎng)的生長條件，解淀粉芽孢桿菌NBRI-SN13 在改善各種非生物脅迫（如鹽、干旱、干燥、熱、冷、凍等）中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，所有的非生物脅迫和植物激素處理都顯著影響植物的各種生理生化參數(shù)，如膜完整性和滲透液積累等。在不同的非生物脅迫和植物激素處理下，NBRISN13 能積極調控應激反應基因的表達?？梢姡獾矸垩挎邨U菌能使植物對各種非生物脅迫的應變能力，增加植物的耐非生物脅迫的耐受性。提高植物的耐受性對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

7 解淀粉芽孢桿菌的對污染物和毒素的降解作用的研究

7.1 解淀粉芽孢桿菌對毒素降解能力的研究

解淀粉芽孢桿菌對植物病原真菌的抑制作用也表現(xiàn)在對其毒素的降解作用。赭曲霉毒素A（OTA）是一種廣泛存在于食品和飼料產(chǎn)品中的毒素，是一種有毒的真菌污染物，由青霉屬和幾種曲霉屬產(chǎn)生，OTA 解毒微生物的鑒定和利用是對該毒素是凈化的最佳途徑。Chang 等［32］從玉米儲藏庫中分離淀粉樣芽孢桿菌ASAG1 能有效降解OTA。從解淀粉樣芽孢桿菌的基因組中克隆了一種與OTA 酶轉化相關的水解酶（羧肽酶）。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，成功地表達和純化了這種羧肽酶。解淀粉芽孢桿菌 ASAG1 產(chǎn)生的羧肽酶可能是引起OTA 生物降解的主要原因。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種由鐮刀菌屬（Fusarium）產(chǎn)生的非甾體雌激素真菌毒素。lee等［33］從發(fā)霉的玉米樣品中分離解淀粉芽孢桿菌LN顯示出很高ZEN 去除能力。在含有3.5 ppm ZEN 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌LN 后，ZEN 濃度在24 小時內(nèi)下降到檢測限以下?？梢姡獾矸垩挎邨U菌具有降解真菌毒素的作用，在去除真菌污染物的應用中具有重要潛力。

7.2 解淀粉芽孢桿菌對環(huán)境污染性聚合物的降解研究

解淀粉芽孢桿菌還可以降解環(huán)境污染物。低密度聚乙烯（LDPE）是造成環(huán)境長期持續(xù)污染的主要原因。Das 等［34］從市政府附近固體土壤中分離得到兩株解淀粉芽孢桿菌（BSM-1）和（BSM-2），用于聚合物降解研究。采用低密度聚乙烯薄膜干重減量、培養(yǎng)基酸堿度變化、二氧化碳估算、掃描電鏡、傅立葉變換紅外光譜等方法對低密度聚乙烯薄膜進行了降解分析。掃描電鏡分析表明，這兩種菌株均表現(xiàn)出以低密度聚乙烯（LDPE）為唯一碳源的粘附和生長現(xiàn)象，而傅立葉變換紅外（FTIR）圖像顯示，培養(yǎng)60 d 后，兩種菌株的表面化學變化各不相同。細菌分離株在細胞外培養(yǎng)基中表現(xiàn)出降解產(chǎn)物的解聚過程，說明了其對聚合物的降解作用。與BSM-1相比，BSM-2 的降解效果更好。可見，這些菌株在短時間內(nèi)具有降解低密度聚乙烯薄膜的潛力。解淀粉芽孢桿菌也具有參與降解聚醚氨基甲酸乙酯的能力。Rafiemanzelat 等［35］研究了解淀粉芽孢桿菌M3對新型聚氨酯脲（PEUU）的降解作用。PEUU 可作為M3 碳氮唯一來源，表現(xiàn)了對其生物降解作用。在堿性介質中加入甘露醇或營養(yǎng)肉湯，研究了該有機物對聚合物的共代謝降解作用。采用掃描電鏡、紅外光譜、熱重分析和X 射線衍射等方法對合成聚合物進行了生物降解。將PEUU 與M3 孵育1 個月后聚合物的重量降低了30%-44%。暴露于M3 后，由于聚合物鏈的水解和酶降解PEUU 結構發(fā)生了顯著變化?？梢?，M3 菌株可以聚醚氨基甲酸乙酯作為唯一碳源，對其具有良好降解作用，可望應用于環(huán)境保護。

8 展望

解淀粉芽孢桿菌的生物學特性和相關功能是多種多樣的，包括孢子形成規(guī)律、生物膜形成規(guī)律、促進植物生長規(guī)律、提高植物對非生物脅迫的耐受性、對真菌毒素的降解作用，這些重要功能的規(guī)律和產(chǎn)生機制的闡明有有重要的理論和實踐意義。隨著解淀粉芽孢桿菌分子水平的研究的深入，其各項生理生化的機制必將進一步闡明。解淀粉芽孢桿菌的基因組、轉錄組和蛋白質組學研究將更好地解釋這種益生菌的多種優(yōu)異特性的分子基礎，并最終闡明解淀粉芽孢桿菌的功能機制。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，基因組測序方法的進一步科學化和快速測序工作的簡單化，研究解淀粉芽孢桿菌的基因組更加便捷。利用基因組測序技術對解淀粉芽孢桿菌基因組已經(jīng)成熟，因此可以對特定的優(yōu)良菌株進行全基因組測序，研究其中各基因的功能，或者對重要代謝途徑的合成基因進行敲出，研究相關功能代謝途徑的網(wǎng)絡關系，可以更清楚地了解功能基因的不同生理機制的產(chǎn)生和作用；通過特點解淀粉芽孢桿菌轉錄組的研究，可以揭示其各功能的分子機理；在研究解淀粉芽孢桿菌的相關功能時，通過解淀粉芽孢桿菌的蛋白組學研究，可以清晰地了解功能蛋白的種類和特性，了解功能化合物合成酶的特點和代謝途徑，這都是研究解淀粉芽孢桿菌發(fā)揮生理功能的機制的基礎?？傊?，解淀粉芽孢桿菌是一種多功能的益生菌，其具有的優(yōu)良的生理功能是多種多樣的，因此研究其產(chǎn)生功能的機理也必然不同，需要結合多種研究方法相互補充，多組學研究（基因組學、轉錄組學和蛋白組學）的研究已經(jīng)成熟，其在研究解淀粉芽孢桿菌不同生理功能、闡述其機制機理上具有重要意義，能發(fā)揮出更大的作用。