Fsp27 基因沉默載體的構(gòu)建及其對細胞脂解的影響研究

許祥 董維鵬 張少華 馮晨毅 劉田福 燕炯

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，太原 030001）

脂質(zhì)代謝紊亂會造成脂肪堆積，進而引發(fā)肥胖癥、脂肪肝、糖尿病等一系列代謝性疾病［1-2］。在哺乳動物體內(nèi)，異?；蜻^量的脂肪會在脂肪細胞中累積，形成脂滴（Lipid droplets，LD）。脂滴是一個與脂質(zhì)儲存、代謝和分泌密切相關(guān)的細胞器，由甘油三酯（Triglyceride，TG）、膽固醇酯的中性脂肪核心及單層磷脂包被組成［3］。Fsp27 是一種脂滴表面結(jié)合蛋白，是調(diào)控脂滴發(fā)育和脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵因子［4］。Fsp27 蛋白定位于脂滴表面，并富集在脂滴與脂滴的接觸位點（Lipid droplet contact site，LDCS），調(diào)節(jié)脂滴代謝，介導(dǎo)脂滴之間的相互融合形成單個大脂滴［5-6］，但其具體的作用機制尚不明確。

本研究以分化的3T3-L1［7］脂肪細胞作為研究模型，通過構(gòu)建shRNA 基因沉默載體沉默F(xiàn)sp27基因，探究Fsp27基因沉默對脂肪細胞脂解的影響，以及對脂滴的形成、融合過程中的作用，推斷其具體機制，旨在為了解Fsp27基因的生物學(xué)功能、脂類代謝疾病的治療和預(yù)防奠定重要的實驗基礎(chǔ)和提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪細胞系、DMEM 高糖細胞培養(yǎng)基、BCA 蛋白定量試劑盒、β-Actin 抗體、山羊抗兔Ig G 抗體、山羊抗鼠Ig G 抗體（武漢BOSTER 生物工程公司），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰島素（Ins）、Lipofectamine 3000、P3000TM試劑、油紅O 染料（Sigma 公司，美國），真核表達載體（編號：GV104）（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司），甘油三酯檢測試劑盒、甘油含量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），HSL抗體、ATGL 抗體、Fsp27 抗體（Abcam 公司，英國），PPARγ 抗體（Bioworld 公司，美國），GAPDH（CST公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 sh-Fsp27 干擾載體的構(gòu)建 查找NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中小鼠Fsp27基因mRNA（NM_001301295）堿基序列，設(shè)計3 條與小鼠Fsp27基因序列一致，且與其它基因同源性最低的陽性序列，同時再設(shè)計1 條與小鼠Fsp27基因無任何同源性的陰性對照序列（表1）。設(shè)計好的4 個靶點序列委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。構(gòu)建帶有RFP 紅色熒光的真核表達質(zhì)粒載體GV104，鑒定其DNA 序列。3 條陽性重組干擾載體分別命名為sh-Fsp27-1、sh-Fsp27-2、sh-Fsp27-3，陰性對照為sh-Fsp27-0。

表1 小鼠sh-Fsp27 重組載體干擾靶點

1.2.2 質(zhì)粒的擴增（工具菌培養(yǎng)）與提取 取適量菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)，待培養(yǎng)平板上長出單個菌落后，挑取菌落接種于含有氨芐青霉素（終濃度為50 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基中。將接種好的錐形瓶置于37℃恒溫搖床中220 r/min，振蕩培養(yǎng)16 h。采用堿裂解法，嚴(yán)格按天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書在無菌環(huán)境中提取質(zhì)粒。通過微孔板分光光度計測定質(zhì)粒的濃度和純度（A260/A280值），剩余質(zhì)粒放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 用含10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1 前脂肪細胞：將其放置于環(huán)境為37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 更換完全培養(yǎng)液1 次。將細胞接種于6 孔板中，待細胞匯合至80%左右時，按本課題組前期優(yōu)化過的經(jīng)典“雞尾酒”方法，誘導(dǎo)分化3T3-L1 前脂肪細胞成為成熟的脂肪細胞。對照組誘導(dǎo)分化后用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2 d 換液1 次，sh-Fsp27-0 組（即陰性對 照組）、sh-Fsp27-1 組、sh-Fsp27-2 組、sh-Fsp27-3 組在誘導(dǎo)分化4 d 時進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。

1.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 sh-Fsp27-0 組、sh-Fsp27-1 組、sh-Fsp27-2 組、sh-Fsp27-3 組細胞在誘導(dǎo)分化4 d 時，取出六孔板，按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，37℃孵育細胞2 d，然后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 油紅O 染色 在細胞干預(yù)完成后，棄掉六孔板中培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛緩沖溶液，室溫固定細胞1 h。用PBS 洗凈殘留的多聚甲醛緩沖溶液，每孔加入油紅O 工作液1 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）。室溫染色1 h 后蒸餾水清洗殘留油紅O 工作液，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 TG 含量與甘油含量檢測 細胞干預(yù)完成后，收集6 孔板中的細胞至EP 管。每個EP 管中加入900 μL PBS 緩沖液，用槍頭吹打細胞沉淀至細胞懸浮。在冰水浴條件下進行超聲破碎細胞。制備好的勻漿液直接按照甘油三酯（TG）試劑盒檢測說明書測定TG 含量，每組以細胞總蛋白濃度對測定值進行校正。制備好的勻漿液70℃金屬浴10 min，滅活脂肪水解酶，嚴(yán)格按照甘油測定試劑盒說明測定樣本甘油含量。根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本的甘油含量，并以每mg 蛋白濃度對測定值進行校正。

1.2.7 Western-blot 檢測細胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ 蛋白表達 收集各組細胞沉淀至EP 管中，加入200 μL 細胞總蛋白裂解液，冰上裂解10 min，4℃、12000 r/min 離心15 min，取上層液體即為待測總蛋白樣品。采用BCA 法測定各組待測樣品的總蛋白濃度，并調(diào)平濃度。PAGE 電泳，電泳參數(shù)：濃縮膠80 V 恒壓，分離膠120 V 恒壓；濕式轉(zhuǎn)膜，參數(shù)：220 mA 恒定電流，轉(zhuǎn)膜持續(xù)2 h。取出NC 膜，浸入封閉液中封閉2 h。蛋白一抗4℃過夜孵育。次日，取出條帶，孵育二抗，37℃搖床2 h。顯影儀曝光目的條帶，挑選出目的條帶清晰、背景淺的圖片。用ImageJ 軟件對目的蛋白條帶進行分析并測定吸光度值，以β-actin 進行校正。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用x-±s來描述。計量資料采用t檢驗進行分析，多組樣本均數(shù)比較采用one-way ANOVA 進行分析。

2 結(jié)果

2.1 干擾載體的鑒定

通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳，4 組質(zhì)粒電泳條帶均位于6500 bp 附近（圖1-A），提取的質(zhì)粒準(zhǔn)確，可進行后續(xù)實驗。經(jīng)過DNA 測序結(jié)果證實，3 個sh-Fsp27 陽性干擾載體中的插入的shRNA 編碼序列正確，與預(yù)期設(shè)計合成的干擾序列相符合（圖1-B）。

2.2 質(zhì)粒濃度、純度

經(jīng)DH5α 大腸桿菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度為300-700 μg/mL，A260/A280均介于1.8-2.0 之間，可用于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（表2）。

圖1 sh-Fsp27 質(zhì)粒序列鑒定

表2 質(zhì)粒濃度和純度鑒定（±s）

表2 質(zhì)粒濃度和純度鑒定（±s）

Vector A260/A280 Concentration/（μg·μL-1）sh-Fsp27-0 1.87±0.03 430±7.8 sh-Fsp27-1 1.83±0.15 356±5.2 sh-Fsp27-2 1.90±0.07 468±8.2 sh-Fsp27-3 1.94±0.15 536±10

2.3 細胞轉(zhuǎn)染效果及Fsp27蛋白的沉默效果

細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染4 d 后，熒光顯微鏡下觀察拍照顯示：4 組紅色熒光蛋白基本表達一致，轉(zhuǎn)染效率在45%左右（圖2-A），陰性對照組和陽性sh-Fsp27 干擾載體之間的轉(zhuǎn)染效果沒有顯著差異。Western blot 結(jié)果顯示，與sh-Fsp27-0 組和空白組比較，3 個陽性干擾載體可以明顯下調(diào)Fsp27 蛋白的表達量（P＜0.05）（圖2-B），且在3 個陽性載體中sh-Fsp27-2 干擾載體下調(diào)Fsp27 蛋白表達的效果最好，后續(xù)實驗以sh-Fsp27-2 作為陽性組。

圖2 Fsp27 基因沉默效果

2.4 脂肪細胞中脂滴的變化

未分化的3T3-L1 前脂肪細胞呈纖維樣，胞質(zhì)內(nèi)無明顯脂滴。誘導(dǎo)分化后，細胞形態(tài)由成纖維樣變?yōu)閳A形，伴隨著胞體的增大，胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴。油紅O 將細胞中的脂質(zhì)染成紅色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察可見，對照組與sh-Fsp27-0 組脂滴生成較快，8 d時能明顯觀察到脂滴聚集，12 d 可見小脂滴融合成大脂滴；陽性sh-Fsp27 組均可見大量小脂滴廣泛地分布于細胞核周圍，且在12 d 時仍未出現(xiàn)明顯的大脂滴（圖3）。

圖3 脂滴油紅O 染色

2.5 脂肪細胞內(nèi)TG和甘油含量

采用酶學(xué)方法檢測3T3-L1 脂肪細胞內(nèi)的TG 和甘油含量。與對照組和sh-Fsp27-0 組相比，陽性sh-Fsp27 組中TG 含量明顯下降，甘油含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

2.6 脂肪細胞中MAPK信號通路及脂肪水解酶的表達

經(jīng)Western blot 檢測顯示（圖4），與空白對照組和陰性對照組相比，陽性sh-Fsp27 組PPARγ 蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性sh-Fsp27 組ATGL 蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各組之間HSL 蛋白表達量無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組的TG 和甘油含量

3 討論

圖4 各組蛋白表達情況

脂肪組織是集體貯存和提供能量的主要組織，當(dāng)脂質(zhì)代謝紊亂時就會引發(fā)肥胖癥、脂肪肝、高脂蛋白血癥等疾病，嚴(yán)重危害人們的健康［8-9］。脂滴是脂肪組織的主要貯存場所，其表面存在眾多的脂滴相關(guān)蛋白，在脂肪的代謝、轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用［10］。Fsp27 是新近才發(fā)現(xiàn)的一種脂滴相關(guān)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Fsp27 在促進脂滴融合，形成單房大脂滴，調(diào)控甘油三酯貯存方面具有重要作用，但其具體的作用機制尚不明確［11］。

Fsp27 蛋白表達于脂肪細胞中，當(dāng)兩個小脂滴相互接觸時，F(xiàn)sp27 在脂滴之間的接觸點富集，小脂滴中的中性脂質(zhì)定性轉(zhuǎn)移到大的脂滴中，導(dǎo)致小脂滴的相互融合形成大脂滴［12］。本實驗使用RNAi技術(shù)，成功構(gòu)建了3 條Fsp27 基因沉默載體，并且證明了sh-Fsp27-2 組載體的效率最高，可用于后續(xù)實驗。成功沉默了Fsp27基因，可以明顯觀察到脂肪細胞內(nèi)大脂滴數(shù)量減少，小脂滴廣泛分布，說明Fsp27基因表達量的減少可以抑制小脂滴的融合，使其呈“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)包圍著細胞核，從而減少了大脂滴的生成，結(jié)果與之前的報道一致［7，13］。在脂肪分解的過程中，細胞內(nèi)甘油三酯水解主要是通過激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）和甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）兩種關(guān)鍵脂肪水解酶來完成的。本實驗中可以明顯觀察到陽性實驗組中TG 含量減少，而甘油含量增加，說明通過下調(diào)Fsp27 基因的表達可以促進甘油三酯的水解。Fsp27 可以激活A(yù)TGL 的抑制因子早期生長反應(yīng)蛋白1（Early growth response protein 1，Egr1），從而抑制ATGL 的轉(zhuǎn)錄水平［14-15］。本次實驗在降低脂肪細胞中Fsp27 的表達后，可以觀察到ATGL 表達升高，而ATGL 表達量的增加，進一步促進了脂肪的水解。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPARγ）是調(diào)節(jié)脂肪形成和能量代謝的關(guān)鍵因子，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的下游靶點，其作為核轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控Fsp27 的表達，促進脂肪細胞的分化和脂質(zhì)沉積［16-17］。在沉默F(xiàn)sp27基因后，F(xiàn)sp27 蛋白的表達減少，從而負反饋調(diào)節(jié)使PPARγ 的表達升高（圖5）。PPARγ 表達的升高也從側(cè)面印證了Fsp27基因通過PPARγ 通路促進脂肪的生成，對脂肪細胞中甘油三酯的蓄積起正調(diào)控的作用。

圖5 Fsp27 與MAPK/PPARγ 信號通路

4 結(jié)論

綜上所述，sh-Fsp27-2 組基因沉默載體的效率最高，沉默F(xiàn)sp27基因可以促進3T3-L1 前脂肪細胞的脂解。推測其作用機制可能是：Fsp27基因表達的缺失抑制了小脂滴的相互融合，增大了脂肪酶的接觸面積，減少了對ATGL 轉(zhuǎn)錄的抑制，增強了ATGL介導(dǎo)的脂肪水解作用，從而促進了3T3-L1 前脂肪細胞的脂解。Fsp27基因通過PPARγ 通路促進脂肪的生成，對脂肪細胞中甘油三酯的蓄積起正調(diào)控的作用。