屎腸球菌纖維素結(jié)合域谷氨酸脫羧酶構(gòu)建及其酶學性質(zhì)

楊勝遠，林謙，賴麗萍，黃婷婷

1(嶺南師范學院 化學化工學院，廣東 湛江，524048) 2(玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林，537000)

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)可專一地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)α-羧基脫羧作用，在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)生物合成和手性物質(zhì)DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)拆分方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。由于乳酸菌的安全性較好，便于在發(fā)酵食品中應(yīng)用，乳酸菌GAD受到了極大關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)Lactobacillusbrevis[4]、Lactobacillusfutsaii[5]、Lactobacillusrhamnosus[6]、Lactobacillussakei[7]、Streptococcussalivariusssp.thermophilus[8]、Pediococcuspentosaceus[9]、Enterococcusfaecium[10]和Lactobacillusplantarum[11]等微生物均具有GAD。然而，由于乳酸菌生長易受其代謝產(chǎn)生的乳酸抑制，生長緩慢，GAD產(chǎn)量低，難以滿足生產(chǎn)需要。為了降低GABA合成和DL-Glu拆分成本，一些學者對GAD進行了固定化研究，以期重復利用GAD。已有文獻報道利用多孔硅球[11]、殼聚糖、戊二醛[12]、羧基化磁性微球[13]、細菌纖維素[14]和金屬親和樹脂[15-16]對不同來源GAD進行了固定化，然而，從固定化成本、固定化酶強度、固定化載體安全性、固定化酶活力等工業(yè)應(yīng)用角度綜合考量，現(xiàn)有方法尚有待完善，所以研發(fā)工藝簡單、成本低和環(huán)境友好的固定化方法仍是酶工程領(lǐng)域的重要課題。

纖維素來源豐富，價格低廉，化學惰性，對大多數(shù)蛋白質(zhì)非特異性親和力低，是一種優(yōu)質(zhì)的載體。大多數(shù)纖維素降解酶包含3個結(jié)構(gòu)域：纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose-binding domain，CBD)、柔性連接區(qū)域和催化結(jié)構(gòu)域[17-19]，因此可利用CBD能與纖維素特異和不可逆結(jié)合的特性，將CBD開發(fā)為親和標簽，構(gòu)建融合蛋白，實現(xiàn)與纖維素親和吸附的目的[19-23]。要實現(xiàn)這一目標，CBD融合酶的構(gòu)建、高效表達以及有效維持或改善原天然酶的酶學特性是該技術(shù)的關(guān)鍵。

不同種類的酶結(jié)構(gòu)存在差異，甚至是同一種酶，其結(jié)構(gòu)也可能因來源不同而差異顯著。例如，Lactococcuslactissubsp.lactisGAD只有一個亞基，亞基分子量約為54 kDa[24]；Streptococcussalivariusssp.thermophilusGAD具有2個亞基，亞基分子量約為46.9 kDa[25]；而EscherichiacoliGAD含有6個相同的亞基，分子量約為53 kDa[26]。由此可見，雖然通過構(gòu)建CBD融合酶實現(xiàn)酶的固定化已有報道，但是由于酶的結(jié)構(gòu)差異性，CBD融合酶能否構(gòu)建成功、融合酶的活性以及酶學性質(zhì)是否會發(fā)生改變等方面尚存在極大不確定性。由此可見，該項技術(shù)尚未成熟，亟需更多研究進行補充和完善。

前期研究已表明，屎腸球菌(E.faecium)具有較高GAD活性，在GABA生物合成方面具有較好的開發(fā)利用前景[10]。本實驗主要對E.faecium纖維素結(jié)合域谷氨酸脫羧酶(CBD-GAD)的構(gòu)建、純化及其酶學性質(zhì)進行探討，以期為纖維素親和固定化E.faeciumGAD提供理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.faeciumGDMCC 60203作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，是嶺南師范學院綠色生物制造研究室從泡菜中分離獲得，是本實驗GAD基因gadB來源菌株。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5ɑ由玉林師范學院生物與制藥學院林謙博士提供，用于CBD-GAD融合酶的表達。E.coliGDMCC 60445作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，為本實驗自行構(gòu)建的可表達CBD-GAD融合酶的重組菌株。

層析硅膠G薄板，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；γ-氨基丁酸(質(zhì)量分數(shù)≥99%)、5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate, PLP)、異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)，美國Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺(均為色譜純)，美國TEDIA公司；氨芐青霉素(美國藥典級)，生工生物工程(上海)有限公司；細菌基因組提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒康,世紀生物技術(shù)公司；TransStart FastPfuDNA聚合酶，全式金生物技術(shù)公司；TaqDNA聚合酶、pMD19 Simple T載體、In-fusion HD基因克隆試劑盒，大連寶生物工程公司。其他試劑為市售生化試劑或分析純試劑。

載體pRPOCB為自行構(gòu)建的E.coli質(zhì)粒，主要在pUC57質(zhì)粒中插入了脅迫誘導型啟動子PrpoS、cbm3(來自Clostridiumthermocellum的家族Ⅲ纖維素結(jié)合域)編碼序列和T7終止子序列。

引物efa-1、efa-2、Infu-13、Infu-22、Infu-24和Infu-27均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

LB培養(yǎng)基參照文獻[27]配制，略有改變。胰蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.0。

PSB(peptone-sucrose-beef extract)培養(yǎng)基參照文獻[10]配制，略有改變。蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖12.5 g/L、乙酸鈉6 g/L、L-谷氨酸一鈉(monosodium glutamate，MSG)10 g/L、吐溫-80 1.0 g/L，pH 7.0。

上述培養(yǎng)基按照配方配制，分裝于規(guī)格為250 mL三角瓶，每瓶120 mL，121 ℃滅菌20 min，臨用前加入240 μL 50 mg/mL氨芐青霉素。

再生無定形纖維素(regenerated amorphous cellulose，RAC)參照文獻[28]制備。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高效液相色譜儀(配置G1354A四元梯度泵、G1316A 柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站)，美國安捷倫公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市精達儀器制造有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市三和儀器有限公司；AUW120電子分析天平，日本Shimadzu公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備

E.faeciumGDMCC 60203種子液制備：從4 ℃保藏的菌種斜面挑取1環(huán)，接入PSB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后按體積分數(shù)1%的接種量再次接入PSB培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

E.coliDH5ɑ和E.coliGDMCC 60445種子液制備：吸取-25 ℃甘油保藏的菌種1 mL，接入LB培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.2E.faeciumCBD-GAD重組大腸桿菌的構(gòu)建

1.3.2.1E.faecium的gadB基因克隆

采用細菌基因組提取試劑盒，按照其說明書提取E.faecium基因組DNA，具體方法為：取E.faeciumGDMCC 60203種子液5 mL，4 ℃、8 500 r/min離心15 min，收集菌體，加入180 μL酶解緩沖液重懸菌體，37 ℃保溫30 min，再依次加入20 μL蛋白酶K和200 μL緩沖液GL，旋渦振蕩混勻, 56℃保溫30 min，然后加入200 μL無水乙醇，旋渦振蕩混勻，即為細胞酶解液。將細胞酶解液加入到已裝入收集管的吸附柱，以12 000 r/min離心1min，棄收集管中的廢液，按此相同的加液、離心、棄廢液操作，依次分別用500 μL緩沖液GW1、500 μL緩沖液GW2洗滌吸附柱。將經(jīng)離心脫液的吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干，然后將吸附柱置于一個新的1.5 mL離心管中，向吸附柱中間懸空部位加入100 μL緩沖液GE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心1 min，收集離心管中的DNA溶液即為E.faeciumGDMCC 60203基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI中的E.faecium基因組序列，設(shè)計和合成引物efa-1和efa-2,用于擴增谷氨酸脫羧酶基因gadB：

efa-1: 5′-ATGTTATACGGAAAAGATAATCAAGAA G-3′

efa-2: 5′-TTAGTGAGTAAAGCCGTACGTTTTCAC-3′

以基因組DNA為模版，以efa-1和efa-2為引物，使用TransStart FastPfuDNA聚合酶擴增，PCR程序為：95 ℃、2 min；95 ℃、20 s，50 ℃、30 s，72 ℃、55 s，循環(huán)33次；72 ℃、5 min。擴增結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入1 μLTaqDNA聚合酶，72 ℃、20 min，使PCR產(chǎn)物3′端得到突出的堿基A。電泳切膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD19 Simple T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒pMD-EfagadB，委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.3.2.2 CBD-GAD融合酶表達載體及重組大腸桿菌的構(gòu)建

設(shè)計和合成引物Infu-13、Infu-24、Infu-22和Infu-27：

Infu-13: 5′-GTTTGGGGTAAAGAACCGGGATCC ATGTTATACGGAAAAGATAATCAAGAAG-3′

Infu-24: 5′-GCCCTCGAGGAATTCTTAGTGAGTAAAGCCGTACGTTTTCAC-3′

Infu-22: 5′-GAATTCCTCGAGGGCTCTTCCAG-3′

Infu-27: 5′-GGATCCCGGTTCTTTACCCCAAACC-3′

以Infu-13和Infu-24為引物，以pMD-EfagadB作為模板，通過PCR擴增gadB基因，電泳切膠，回收純化gadB基因；以Infu-22和Infu-27為引物，以pRPOCB質(zhì)粒作為模板，通過PCR擴增制備線性化的載體，電泳切膠，回收純化目的片段。使用TransStart FastPfuDNA聚合酶擴增，PCR程序為95 ℃、2 min；95 ℃、20 s，54 ℃、30 s，72 ℃、105 s，循環(huán)33次；72 ℃、5 min。

將gadB基因與線性化載體pRPOCB用In-fusion HD基因克隆試劑盒進行拼接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRPOCB-EfagadB。反應(yīng)體系為：2 μL In-fusion酶、1 μLgadB基因、2 μL 線性化載體、5 μL ddH2O，總計10 μL。離心30 s，50 ℃連接15 min。

將pRPOCB-EfagadB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落，提取質(zhì)粒后，用BamH I、EcoR I雙酶切質(zhì)粒，進行電泳檢測。轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pRPOCB-EfagadB的E.coliDH5α菌株即為E.coliGDMCC 60445。

1.3.2.3 CBD-GAD融合酶的表達

將20 mLE.coliGDMCC 60445接于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)9～10 h，再取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到120 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵液。

1.3.2.4 CBD-GAD融合酶的提取與固定化

將120 mLE.coliGDMCC 60445發(fā)酵液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，收集菌體，加入30 mL生理鹽水，攪拌分散洗滌菌體，再次離心收集菌體，然后加入pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液10 mL，在冰水浴中以400 W功率，超聲波破碎細胞(工作5 s，冷卻5 s，全程50 min)。將細胞破碎液于8 500 r/min、 4 ℃離心15 min，上清液即為CBD-GAD融合酶粗酶液。

稱取0.8 g RAC濕質(zhì)量與8 mL CBD-GAD粗酶液混合，30℃、50 r/min振蕩15 min，濾出液體，然后采用40 mL pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液分5次洗滌固形物，再采用40 mL pH 4.8、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液分5次洗滌固形物，濾除洗滌液，即可獲得RAC固定化CBM-GAD(RAC-CBD-GAD)。

1.3.2.5 RAC-CBD-GAD活性測定

為了避免E.coli受自身基因組表達的E.coliGAD的影響，本實驗通過測定RAC-CBD-GAD活性以評價CBD-GAD融合酶的表達情況。

將0.2 g RAC-CBD-GAD與10 mL pH 4.8、0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)混合，40 ℃、80 r/min水浴振蕩反應(yīng)30 min，立即吸取0.5 mL反應(yīng)液與0.5 mL無水乙醇混合以終止反應(yīng)， 8 500 r/min離心15 min，取上清液定性和定量測定GABA。

GABA定性檢測：將上清液用蒸餾水適當稀釋后，采用薄層層析(thin-layer chromatography, TLC)進行鑒定；展開劑為正丁醇∶冰乙酸∶水(體積比6∶1∶1)，且含3 g/L茚三酮；發(fā)色溫度90 ℃。

GABA定量檢測：參照文獻[29]采用HPLC進行測定。取100 μL標準溶液或樣品液注入1.5 mL的錐形離心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC(體積比7∶1∶1∶1)，混勻，室溫放置1 h，加入150 μL流動相A-流動相B(體積比80∶20)，旋渦混合器振蕩1 min，然后加入600 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，最后靜置10 min。用注射器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測。HPLC色譜條件為：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長254 nm；進樣量20 μL，柱溫25℃；采用流動相A與流動相B(體積比80∶20)以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動相A：pH 5.6、0.1 mol/L乙酸鹽緩沖液，1 L緩沖液中分別含三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL。流動相B：體積分數(shù)為60%的乙腈溶液。

RAC-CBD-GAD活力單位定義為：測定條件下1 min生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。以單位質(zhì)量RAC-CBD-GAD所具有的GAD活力表示(U/g)。

1.3.2.6 重組E.coliGDMCC 60445的穩(wěn)定性

吸取-25 ℃甘油保藏的菌種1 mL，轉(zhuǎn)接于不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，再吸取1 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，重復轉(zhuǎn)接5次，然后吸取2 mL接入120 mL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活性。以含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基按照同樣操作收集的細胞作為對照。

1.3.3 CBD-GAD融合酶的純化

按RAC與CBD-GAD粗酶液的質(zhì)量體積比為1∶20的比例按上述方法進行固定化，將固定化酶RAC-CBD-GAD用pH 8.0、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液充分洗滌，然后將每1 g RAC-CBD-GAD與20 mL乙二醇混合，靜置脫吸附10 min，濾出酶液，將酶液用超濾管以3 000 r/min進行離心超濾，再通過多次加入生理鹽水、離心超濾的循環(huán)操作去除乙二醇，即可獲得基本不含乙二醇的CBD-GAD酶液。參照SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒說明書，采用SDS-PAGE電泳鑒定CBD-GAD，濃縮膠質(zhì)量濃度5%，分離膠質(zhì)量濃度8%，膠厚1.0 mm。蛋白質(zhì)濃度參照Bradford法蛋白濃度測定試劑盒說明書進行測定。

1.3.4 CBD-GAD純酶的酶學性質(zhì)研究

1.3.4.1 CBD-GAD活性測定方法

除特別說明外，CBD-GAD活性測定條件為：取1.5 mL pH 4.8、0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)，加入1.5 mL CBD-GAD純酶，40 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入4 mL無水乙醇，混勻、終止反應(yīng)，8 500 r/min離心15 min，取上清液適當稀釋后采用HPLC測定GABA含量。CBD-GAD活力單位定義為：測定條件下1 min生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。除對照組平均CBD-GAD活力為100%外，未設(shè)置對照組的實驗以活力最高的實驗組平均CBD-GAD活力為100%計算相對酶活(%)。

1.3.4.2 pH對CBD-GAD的影響

pH對CBD-GAD反應(yīng)活性的影響：分別以pH 4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2和5.4的0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)作為底物進行酶活測定。

pH對CBD-GAD穩(wěn)定性的影響：將CBD-GAD酶液分別與pH 3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6 的0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液按體積比1∶1混合，于40 ℃保溫5 h，然后對處理后的CBD-GAD酶液進行酶活測定。

1.3.4.3 溫度對CBD-GAD的影響

溫度對CBD-GAD反應(yīng)活性的影響：分別在40、45、50、55、60、65和70 ℃下進行酶活測定。

溫度對CBD-GAD穩(wěn)定性的影響：將CBD-GAD酶液與pH 4.8、0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液按體積比1∶1混合，分別于-25、-20、-7、4、40、50、60和70 ℃保溫3 h，然后室溫下放置1 h，再取處理后的CBD-GAD酶液進行酶活測定。以4 ℃處理組為對照。

1.3.4.4 CBD-GAD底物特異性

分別取pH 4.8的0.25 mol/LL-Glu、D-Glu、L-Asp溶液1.5 mL，加入0.5 mL CBD-GAD酶液，快速混勻，于40 ℃水浴反應(yīng)2 h，然后100 ℃保溫10 min終止酶活，4 ℃、8500 r/min離心15 min，用HPLC測定L-Glu、D-Glu、L-Asp含量，測定方法參照上述HPLC測定GABA的方法。以121 ℃滅活10 min的CBD-GAD酶液進行同樣操作作為對照。

以底物濃度的平均變化率[(實驗組濃度-對照組濃度)/對照組濃度×100%]對反應(yīng)活性進行比較。根據(jù)試驗過程存在系統(tǒng)誤差，將底物的平均變化率絕對值≤5%判定為陰性(-)，變化率絕對值>5%判定為陽性(+)。

1.3.4.5 CBD-GAD動力學常數(shù)

分別以pH 4.8的0.4、0.8、1.2、2.4、3.6、4.8、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、51.2、76.8、89.6、102.4、128、153.6、204.8 mmol/LL-Glu溶液作為底物進行酶活測定，選擇呈一級反應(yīng)關(guān)系的底物濃度和反應(yīng)速度，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算GAD的Km和Vmax。

1.3.4.6 GABA對CBD-GAD活性的影響

以含0.1 mol/L GABA的0.25 mol/LL-Glu混合溶液為底物進行酶活測定，同時以不含GABA的0.25 mol/LL-Glu溶液作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均為3個平行，結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示。采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.faecium CBD-GAD重組大腸桿菌的構(gòu)建

2.1.1gadB基因克隆

以E.faeciumGDMCC 60203的基因組DNA為模板，擴增出的產(chǎn)物為大小1.4 kb(圖1)。測序結(jié)果表明，該基因與Enterococcussp. JK29的gadB基因(1 401 bp，GenBank登錄號：KM649684)100%一致。

M-Marker；1-PCR產(chǎn)物圖1 PCR擴增E. faecium GDMCC 60203 gadB基因的電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of gadB gene by PCRamplified from E. faecium GDMCC 60203

2.1.2 CBD-GAD融合酶表達載體及重組大腸桿菌的構(gòu)建

將E.faeciumGDMCC 60203的gadB基因與pRPOCB線性化載體拼接后，得到pRPOCB-EfagadB重組質(zhì)粒(圖2)，該重組質(zhì)粒包含了脅迫誘導型啟動子PrpoS、E.coli中 5′-非翻譯區(qū)和來自編碼C.thermocellum家族3纖維素結(jié)合域的序列cbm3和E.faeciumLNSF2 GAD的基因gadB。從序列推斷，用BamH I、EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒，應(yīng)切出3 723 bp、1 407 bp兩條帶，對酶切產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)果(圖3)與理論推斷一致，表明重組質(zhì)粒pRPOCB-EfagadB構(gòu)建成功。

將pRPOCB-EfagadB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得了攜帶CBD-GAD融合酶表達載體的重組E.coliGDMCC 60445。

2.1.3 CBD-GAD融合酶的表達

RAC對CBD具有特異性吸附性能，采用RAC對E.coliGDMCC 60445的CBD-GAD進行吸附固定化，避免了E.coli自身基因組所表達的GAD的影響。經(jīng)采用TLC對RAC-CBD-GAD的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行檢測，圖4顯示存在與GABA標準品遷移率一致的斑點，HPLC定量分析表明RAC-CBD-GAD活力為(349.54±33.47) U/g，結(jié)果表明E.coliGDMCC 60445可高效表達具有GAD催化活性的CBD-GAD。

圖2 表達載體pRPOCB-EfagadB示意圖Fig.2 Map of the expression vector pRPOCB-EfagadB

M-Marker；1-pRPOCB-EfagadB的BamH I和EcoR I酶切產(chǎn)物圖3 pRPOCB-EfagadB酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of the digestion products ofpRPOCB-EfagadB

1- GABA標準品;2-RAC-CBD-GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)液;3-L-Glu標準品圖4 RAC-CBD-GAD轉(zhuǎn)化液薄層層析圖譜Fig.4 Thin-layer chromatography of the conversionliquid of RAC-CBD-GAD

2.1.4 重組E.coliGDMCC 60445的穩(wěn)定性

對含氨芐青霉素抗性標記的重組菌，通常需要在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素以防止重組菌丟失質(zhì)粒。然而，氨芐青霉素價格昂貴，安全性差，工業(yè)應(yīng)用成本高、風險大。經(jīng)對E.coliGDMCC 60445穩(wěn)定性進行測試，實驗組RAC-CBD-GAD活力為(347.93±27.63) U/g，與對照組(329.29±10.37) U/g無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5批次，E.coliGDMCC60445性能穩(wěn)定，未受氨芐青霉素影響。

2.2 CBD-GAD融合酶的純化

由于RAC對CBD具有特異性吸附性能，因此只需對RAC-CBD-GAD充分洗滌以去除未吸附的雜蛋白，然后采用乙二醇進行脫吸附處理，即可實現(xiàn)CBD-GAD純化。圖5顯示，純化后的CBD-GAD酶液在SDS-PAGE電泳圖上呈現(xiàn)單一蛋白質(zhì)條帶，說明CBD-GAD已經(jīng)達到了電泳純。CBD-GAD純酶的比酶活為(50.57±4.44) U/mg。

1-蛋白質(zhì)Marker;2-CBD-GAD粗酶液;3，4-脫吸附CBD-GAD圖5 CBD-GAD融合酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophorogram of fusion enzymeCBD-GAD

根據(jù)電泳分離膠的濃度和蛋白質(zhì)Marker分子量分布情況，選擇SDS-PAGE電泳分子量分布較均勻的條帶(15～100 kDa)的相對遷移距離與蛋白質(zhì)分子量標準的對數(shù)值繪制標準曲線(圖6)，由曲線計算可知CBD-GAD的相對分子量為74.02 kDa，與CBD-GAD理論分子量71.52 kDa基本相符。電泳結(jié)果也表明CBD-GAD融合酶在E.coliGDMCC 60445中獲得成功表達。

圖6 SDS-PAGE測定GAD分子量Fig.6 Molecular weight of GAD on SDS-PAGE

2.3 CBD-GAD純酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 pH對CBD-GAD的影響

圖7-a顯示，當反應(yīng)pH小于4.6，CBD-GAD活力隨pH增加而增強；當反應(yīng)pH為4.6，CBD-GAD活力最強；當反應(yīng)pH大于4.6， CBD-GAD活力隨反應(yīng)pH增加而逐漸下降，但在pH 4.6～5.2范圍內(nèi)下降較為平緩，CBD-GAD活力差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，CBD-GAD在pH 4.6～5.2可保持90%以上的活性，適宜反應(yīng)pH范圍較寬，最適反應(yīng)pH值為4.6。從圖7-b可見，pH值小于4.8，CBD-GAD隨pH降低失活越嚴重，在pH 4.8～5.6相對較穩(wěn)定，40 ℃保溫5 h仍可保持90%以上活力，在pH 4.8最穩(wěn)定。

a-pH對CBD-GAD催化反應(yīng)活性的影響；b-pH對CBD-GAD穩(wěn)定性的影響圖7 pH對CBD-GAD的影響Fig.7 Effect of pH on CBD-GAD

楊勝遠等[30]對E.faeciumGAD天然酶純酶的酶學性質(zhì)研究表明，GAD最適反應(yīng)pH為5.0，當pH偏離最適反應(yīng)pH時，GAD活力快速下降，維持75%以上活力的pH范圍僅為4.8～5.2。由此可見，融合CBD后，在pH對GAD催化活性影響方面發(fā)生了較大變化。

2.3.2 溫度對CBD-GAD的影響

如圖8-a所示，CBD-GAD的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在55～60 ℃范圍可保持90%以上的CBD-GAD酶活；當溫度高于65 ℃，酶活快速下降。圖8-b顯示，CBD-GAD在4～40 ℃相對較穩(wěn)定，經(jīng)pH 4.8、0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液處理3 h后，仍可保持95%以上的酶活；冰凍處理(低于-7 ℃)和高于50 ℃處理對CBD-GAD穩(wěn)定性影響較大，酶活損失較大，當溫度達到70 ℃，CBD-GAD基本完全失活。

a-溫度對CBD-GAD催化反應(yīng)活性的影響；b-溫度對CBD-GAD穩(wěn)定性的影響圖8 溫度對CBD-GAD的影響Fig.8 Effect of temperature on CBD-GAD

2.3.3 CBD-GAD底物特異性

由表1可見，CBD-GAD僅對L-Glu具有催化活性，對僅有一個-CH2差異的L-Asp和僅具有立體結(jié)構(gòu)差異的D-Glu均無催化活性。結(jié)果表明CBD-GAD具有很強的底物專一性。

表1 CBD-GAD對不同氨基酸的催化反應(yīng)活性Table 1 Catalytic activity of CBD-GAD for different amino acids

注：“+”為具有催化活性；“-”為不具有催化活性。

2.3.4 CBD-GAD動力學常數(shù)

從圖9可知，L-Glu濃度低于12.8 mmol/L時，反應(yīng)呈一級反應(yīng)；L-Glu濃度在12.8～76.8 mmol/L范圍內(nèi)，反應(yīng)呈混合級反應(yīng)；L-Glu濃度高于76.8 mmol/L，反應(yīng)呈零級反應(yīng)；CBD-GAD催化反應(yīng)沒有底物抑制現(xiàn)象。結(jié)果表明，CBD-GAD催化反應(yīng)符合Michaelis-Menten的快速平衡學說。根據(jù)圖10計算CBD-GAD的Km和Vmax分別為10.58 mmol/L和3.83 μmol/(mL·min)。

圖9 L-Glu濃度對CBD-GAD催化反應(yīng)速度的影響Fig.9 Effect of L-Glu concentration on the catalyticreaction rate of CBD-GAD

圖10 CBD-GAD動力學常數(shù)Lineweaver-Burk圖Fig.10 Lineweaver-Burk plot of the kinetic constantsof CBD-GAD

2.3.5 GABA對CBD-GAD活性的影響

由圖11可知，初始L-Glu底物溶液中添加 0.1 mol/L GABA的實驗組與不含GABA的對照組的CBD-GAD活性無顯著性差異(P>0.05)，說明CBD-GAD催化活性無產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。

圖11 GABA對CBD-GAD活性的影響Fig.11 Effects of GABA on CBD-GAD activity

3 討論

本實驗通過以PrpoS作為啟動子，成功構(gòu)建了可高效表達CBD-GAD的E.coliGDMCC 60445，該重組菌株在無氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中性能穩(wěn)定。構(gòu)建的CBD-GAD對RAC親和性強，只經(jīng)RAC一步純化即可獲得電泳純化CBD-GAD。與GAD天然酶相比， CBD-GAD對pH的依賴性得到了較大改善，酶的催化專一性未受影響，催化反應(yīng)不受底物和產(chǎn)物抑制，酶學性質(zhì)優(yōu)良。通過構(gòu)建CBD-GAD融合酶，利用纖維素可快速實現(xiàn)GAD固定化和純化，方法簡便、成本低，具有很好的推廣價值。