輔助T細胞亞群分化調控機制研究進展①

張笑梅 劉春燕 邵宗鴻

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院血液科，天津 300052)

在過去20年里，Th亞群家族不斷擴大，目前包括Th1、Th2、Th9、Th17、濾泡輔助性T細胞(Tfh)、調節(jié)性T細胞(Treg)和Th22細胞。這些亞群主要由每個亞群表達的細胞因子、轉錄因子、表觀遺傳修飾及代謝等復雜的調控網(wǎng)絡參與誘導。原始CD4+T細胞分化在很大程度上取決于與淋巴器官樹突狀細胞(DCs)的相互作用，其中細胞因子在Th細胞分化的早期階段起著重要的監(jiān)管作用；為了更好地了解CD4+T細胞分化的復雜機制，有必要了解在分化過程中的轉錄因子結合譜，討論T細胞分化中的轉錄因子,包括 STAT蛋白,主調控因子及 IRF4復合物等；表觀遺傳調控指的是不改變DNA序列通過DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA介導的調控等多種修飾而改變基因表達的行為。越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳修飾能夠通過與轉錄因子之間的合作來確定不同亞群T細胞的分化；另外為適應環(huán)境應繳源，T細胞進行代謝重塑，通過調整其細胞代謝，來調節(jié)淋巴細胞信號傳導，并影響其分化和功能，如發(fā)育或分化、細胞因子的產(chǎn)生和細胞遷移。因此，本文旨在總結目前關于Th細胞亞群在細胞因子、轉錄因子、表觀遺傳學及代謝水平上發(fā)育和分化的分子調控知識，闡明Tfh細胞生物學，探討不同亞群分化造成的免疫功能紊亂而引起的自身免疫性疾病及相關藥物研發(fā)進展，為今后的臨床干預提供潛在靶點。

1 T細胞亞群分化機制

1.1Th1細胞分化機制

1.1.1細胞因子 Th1細胞主要產(chǎn)生IFN-γ幫助宿主防御細胞內病原體(包括病毒、細菌)。IL-12通過上調T-bet使得原始CD4+T細胞向Th1方向發(fā)展；同時，IL-12激活STAT4，活化的STAT4與T-bet結合促進INF-γ產(chǎn)生。研究表明，由于IL12B(編碼IL-12p40亞單元，如IL-12和IL-23)、IL12RB1(編碼β1鏈作用于IL-12和IL-23受體)、IRF8(與產(chǎn)生IL-12的樹突狀細胞有關)和ISG15(與IL-12協(xié)同作用的分子)突變，受試者缺乏功能性IL-12和/或IL-12受體的表達，導致Th1細胞傳代嚴重受損[1]。INF-γ是Th1細胞產(chǎn)生的主要細胞因子，INF-γ通過STAT1激活進一步促進T-bet的表達，形成正反饋回路，共同促進Th1細胞的分化[1]。INFγ-STAT1-T-bet通路是促進Th1體外分化的一種強有力的擴增機制。IL-2也參與調節(jié)Th1細胞分化[2]，它通過誘導IL-12Rβ2鏈(IL-12受體的組成部分，增強對IL-12的反應)的表達導致Th1分化；IL-2也上調Tbx21的表達，從而穩(wěn)定Th1系[3]。

1.1.2轉錄因子 T-bet是參與Th1分化的主要轉錄因子，其表達同時受TCR、IFN-γ和IL-12R信號轉導途徑的控制。T-bet能夠促進IFN-γ表達，同時抑制Th2、Th17細胞分化。與促進Th1細胞分化相比，T-bet分別通過抑制GATA3和RORγt的功能來抑制Th2和Th17的分化[4]。同時T-bet可以與其他轉錄因子形成復合物，進一步增強Th1基因的表達。T-bet可以與Bcl-6形成抑制復合物，通過負調控Socs1、Socs3和Tcf7促進Th1細胞發(fā)展[5]；此外，T-bet與runt相關轉錄因子3(RUNX3)協(xié)同誘導Ifng表達，同時抑制Th1細胞中Il4表達；T-bet與RUNX1相互作用，阻止RUNX1與RORγt結合從而抑制Th17分化[5]；T-bet能夠誘導HLX(一種同源框蛋白)并與之相互作用促進Th1細胞表達IFN-γ。T-bet本身并沒有抑制Tfh細胞分化的功能，但它可以降低Tfh對B細胞提供輔助功能的作用。另外，STAT1和STAT4也是參與Th1分化的重要轉錄因子，它們分別被IFN-γ和IL-12激活，誘導Tbx21基因，編碼T-bet，T-bet進一步驅動Th1分化，促進IFN-γ表達，從而形成正反饋循環(huán)。

1.1.3表觀遺傳修飾 表觀遺傳修飾可以通過DNA甲基化調節(jié)Th1細胞因子表達來指導Th1細胞分化。IFN-γ基因位點可實現(xiàn)DNA去甲基化和組蛋白H3乙?；蛉谆M蛋白H3賴氨酸4(H3K4me3)等修飾，T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域蛋白3(TIM-3)偶爾在Th1細胞中發(fā)現(xiàn)，提示一些潛在 機制可能與TIM-3和Th1細胞有關。DNA甲基化分析確定TIM-3啟動子內的CpG島受DNA甲基化的調控。體外誘導分化的Th1細胞在TIM-3啟動子的特定區(qū)域均表現(xiàn)出DNA去甲基化，提示TIM-3啟動子區(qū)域編碼的某些基因表達增加，促進了Th1細胞的分化[6]。新近研究生長因子獨立性1(Gfi1)在Th1細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)與Th1相關的轉錄因子Gfi1呈負相關。Gfi1與Th1細胞的轉錄因子結合，使得與基因抑制密切相關的組蛋白H3K4甲基化表達降低[7]。Dicer是獲得成熟miRNA所必需的RNaseⅢ酶，在缺乏Dicer的Th細胞中，IFN-γ和T-bet的強烈分泌表明miRNAs在分化階段起負作用。miR-29在原始T細胞中的表達增加，對Th1細胞的分化有明顯的抑制作用，miR-29a在轉基因小鼠中的表達降低可提高血清IFN-γ水平，提示miR-29a通過調節(jié)IFN-γ mRNA的表達而發(fā)揮作用。

1.1.4代謝調節(jié) CD4+T細胞向效應細胞的激活和分化伴隨著從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉變。有氧呼吸在Th1 CD4+T細胞功能中的重要性也通過CD4+T細胞中乳酸脫氫酶(LDHA)的缺失得到了證實，激活的細胞調控其新陳代謝水平回到氧化磷酸化水平，隨后通過影響組蛋白乙?；瘉斫档虸FN-γ產(chǎn)生。從糖酵解到氧化磷酸化的轉變使乙酰-CoA進入TCA途徑,從而減少可用性的組蛋白乙酰化作用和激活IFN-γ位點[8]。Th1 CD4+T細胞對糖酵解的依賴減少了通過線粒體氧化磷酸化(OxPhos)產(chǎn)生的有害ROS的累積。雖然CD4+T細胞激活需要較低水平的活性氧，但長期暴露于活性氧會通過改變DNA修復和信號通路的成分導致細胞死亡[9]。Th1 CD4+T細胞的糖酵解和氧化能力也依賴于轉錄因子IRF4。在Th1 CD4+T細胞,IRF4缺失會導致GLUT3和己糖激酶2表達降低，同時降低IFN-γ+CD4+T細胞的表達[10]。在最近的一項研究中，CD4+T細胞的氨基酸代謝以及糖酵解和OxPhos依賴于ATF4，這是一種被氧化和內質網(wǎng)應激激活的轉錄因子[11]。ATF4缺乏癥可以擾亂包括細胞ROS水平在內的多種途徑。在體外Th1極化條件下,ATF4缺乏的CD4+T細胞在氧化還原、增殖分化、細胞因子產(chǎn)生方面存在缺陷，使得INF-γ降低；T-bet表達更低而Foxp3的表達更高[11]。在實驗性自身免疫性腦炎(EAE)小鼠模型中，ATF4缺乏降低了Th1，但增加了Th17 CD4+T細胞的分化，導致疾病嚴重程度的增加[11]。

1.2Th2細胞分化機制

1.2.1細胞因子 Th2細胞參與對細胞外寄生蟲包括蠕蟲的過敏反應和宿主防御[12]，能夠產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等細胞因子。Th2細胞的分化是在IL-4存在下通過TCR刺激誘導的。IL-4是參與Th2細胞分化的主要細胞因子，它通過阻斷IL-12和IFN-γ來增強Th2分化。同時，IL-4激活STAT6進而誘導GATA3表達，可以促進Th2細胞分化，也有助于維持Th2表型。在大部分CD4+T細胞亞群中，IL-2的作用是促進增殖，而在Th2細胞中，IL-2在驅動原始T細胞向Th2細胞分化中起著重要的驅動作用，IL-2激活STAT5信號通路，通過調節(jié)TCR誘導的IL-4Rα表達，進而調節(jié)Th2細胞的早期分化。在體外Th2細胞分化8 h內，與Il4ra位點結合的STAT5A和STAT5B明顯，通過誘導IL-4Ra的表達，增強IL-4的反應，導致IL-2到IL-4信號級聯(lián)[2,13]。此外，IL-2促進STAT5A和STAT5B在Il4/Il13Th2細胞因子基因座的多個位點結合，從而增加Th2細胞的產(chǎn)生[13]。

1.2.2轉錄因子 GATA3是指導Th2細胞分化的主要轉錄因子，IL-4以STAT6依賴的方式誘導GATA3表達，GATA3進一步促進IL-4-IL-5-IL-13位點向開放構象發(fā)展。使得其他轉錄因子能夠進入該位點參與Th2細胞分化。IL-4高水平表達和GATA3表達的自激活形成了正反饋回路，進一步誘導了GATA3的表達和Th2的分化。同時，GATA3誘導c-Maf表達，刺激c-Maf促進Th2分化[14]。STAT6作為參與Th2細胞分化的另一個重要的轉錄因子，在細胞因子IL-4的激活下誘導GATA3表達，進而促進Th2細胞分化；同時通過抑制STAT4表達和RUNX3介導的Ifng表達進而抑制Th1細胞標志性細胞因子IFN-γ轉錄。另外，其他轉錄因子也參與Th2細胞分化，轉錄因子DEC2在Th2細胞中表達，并通過與啟動子結合來增強GATA3表達[15]。IRF4與NFATc2協(xié)同調控Il4基因表達，進而促進Th2細胞分化[16]。

1.2.3表觀遺傳修飾 DNA甲基化也可以通過調節(jié)Th2細胞因子的表達來指導Th2細胞分化。Th2細胞因子位點可獲得抑制性組蛋白修飾和DNA甲基化。同樣體外誘導分化的Th2細胞在TIM-3啟動子的特定區(qū)域均表現(xiàn)出DNA去甲基化，提示TIM-3啟動子區(qū)域編碼的某些基因表達增加，促進了Th2細胞的分化[6]。Th2細胞分化受Il4位點組蛋白修飾和順式調節(jié)元件的參與控制。組蛋白高乙酰化可能與記憶性Th1和Th2細胞中Ifng和IL4基因啟動子區(qū)的開放染色質狀態(tài)有關。大量研究報道了組蛋白H3乙酰化、Lys-4三甲基化(H3K4me3)和trithorax G(TrxG)在Th2細胞分化中的重要作用。TrxG復合物的產(chǎn)生是在GATA3啟動子區(qū)激活STAT6時發(fā)生的。與Th1細胞相比，miRNA對Th2細胞分化的調控仍需進一步研究。研究證實了miR-21在T細胞體外促進Th2細胞分化的作用[17]，而在miR27或miR128的調控下，IL-4和IL-5的分泌減少[18]。

1.2.4代謝調節(jié) 活化的Th2 CD4+T細胞也依賴糖酵解進行分化并發(fā)揮功能。RhoA是Rho家族小分子量G蛋白的成員之一，具有GTP酶活性，與GTP結合作用于細胞內的效應因子，是Th2 CD4+T細胞糖酵解潛在的關鍵調節(jié)器。RhoA缺失T細胞使得Th2分化缺陷從而減少過敏性氣道炎癥，這與IL-4R、GATA3和磷酸化STAT6水平較低有關[19]。mTORC1通路也調節(jié)活化Th2 CD4+T細胞的糖酵解能力，但與Th1 CD4+T細胞不同，Rheb的缺失并沒有減少Th2 CD4+T細胞的糖酵解[20]，相反，IL-4R、IL-2Ra和GATA3的表達減少證明了Raptor缺失的mTORC1抑制顯著減少了Th2 CD4+T細胞的糖酵解，并削弱了Th2的分化[21]。但是當前研究對于糖酵解和相關調節(jié)因子如何影響Th2 CD4+T細胞相關的細胞因子、受體和轉錄因子的表達仍不清楚。

1.3Th9細胞分化機制

1.3.1細胞因子 Th9細胞作為輔助T細胞的一種亞型，能夠產(chǎn)生IL-9，參與自身免疫性疾病、過敏性反應和抗腫瘤免疫[22]。原始CD4+T細胞在TGF-β和IL-4同時存在的情況下分化為產(chǎn)生IL-9的Th9細胞，而不產(chǎn)生其他Th2類細胞因子，從而發(fā)現(xiàn)TGF-β和IL-4在Th9細胞分化中發(fā)揮重要作用。其中IL-4是誘導Th9細胞最重要的一種細胞因子，IL-4通過下游轉錄因子如STAT6、PU.1和IRF4促進Th9細胞分化。在僅有IL-4存在的條件下，誘導原始CD4+T細胞向Th2細胞分化，IL-4聯(lián)合TGF-β能夠刺激原始CD4+T細胞向Th9細胞分化。而在IL-4缺失的情況下，TGF-β能夠誘導其向Treg分化[23]。當IL-4與其受體結合，進而激活STAT6，促進BATF和IRF4表達[24，25]。TGF-β信號通路在Th9細胞中可誘導Smad活化和PU.1的表達[25]。IL-2也對Th9細胞的分化及IL-9的產(chǎn)生有重要作用，IL-2與受體結合后誘導STAT5的活化，從而促進Th9細胞的分化，阻斷IL-2或抑制STAT5可導致IRF4和PU.1的表達下降，抑制Th9細胞的分化[24-26]。

1.3.2轉錄因子 PU.1和IRF4是參與Th9細胞分化的主要轉錄因子。ETS家族轉錄因子富含嘌呤盒1(PU.1)是Th9特異性轉錄因子[25]。PU.1通過與Il9啟動子結合以及PU.1招募組蛋白乙酰轉移酶調控Il9位點的染色質重構發(fā)揮調控作用[25],通過調節(jié)GATA3抑制Th2的表達，促進Th9的發(fā)育，PU.1缺失小鼠CD4+T細胞IL-9的產(chǎn)生會受到影響[27]。IRF4是Th2細胞中IL-4的作用靶點，同時對Th9的發(fā)育也有影響，IRF4與Il9基因直接作用，IRF4缺陷小鼠原始CD4+T細胞在Th9極化過程中抑制了IL-9的表達，而siRNA介導的IRF4沉默則減弱了IL-9的表達。AP-1家族成員BATF直接與Il9基因結合，表現(xiàn)出與IRF4的協(xié)同作用。在IL-4/STAT6信號缺失的情況下，IRF4的異位表達未能挽救IL-9的表達，提示了Th9細胞發(fā)育需要IL-4下游其他轉錄因子。另外STAT5與STAT6也是Th9分化的重要轉錄因子。最近IL-2-JAK-STAT5信號通路被證明對Th9分化至關重要。在Il9啟動子上具有關鍵的STAT5結合位點，IL-2通過誘導STAT5與Irf4啟動子結合，從而促進IRF4的表達；除IL-2，細胞因子TSLP也能激活STAT5，已經(jīng)證實TSLP誘導Th9分化過程中活化STAT5的表達，從而導致IL-9的產(chǎn)生。STAT6在Th9發(fā)育中的作用已經(jīng)確定：IL-4介導的STAT6激活通過抑制Foxp3和T-bet的表達來促進Th9發(fā)育，而Foxp3和T-bet則可以抑制IL-9的產(chǎn)生，STAT6也促進了IRF4表達，如上所述，IRF4促進Th9分化；磷酸化的STAT6還能促進GATA3表達，在缺少STAT6的情況下，IL-9的產(chǎn)生受到嚴重損害。

1.3.3表觀遺傳修飾 最近一項研究顯示通過抑制甲基化誘導Th9特異性PU.1表達，相反，阻止組蛋白乙酰化降低IL-9誘導刺激后PU.1的表達，表明PU.1的表觀遺傳修飾在調節(jié)Th9分化方面是獨特的[28]。Smad2或Smad4缺乏可導致T細胞IL-9表達受損，這可能是由于抑制染色質修飾組蛋白H3K27三甲基化和增強EZH2與IL-9細胞的結合所致[29]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，ETS轉錄因子ETS變異體5(ETV5)需要在Il9基因啟動子內富集組蛋白乙酰轉移酶(HATs)來增強IL-9+Th9細胞。體外研究表明，在沒有ETV5的情況下p300降低，同時IL-19啟動子中富含組蛋白H3乙?；虷4K16乙?；痆30]。

1.4Th17細胞分化機制

1.4.1細胞因子 Th17細胞作為輔助T細胞的一種亞型，能夠介導抗真菌感染和細胞外細菌免疫。2006年首次報道小鼠CD4+T細胞在IL-6和TGF-β聯(lián)合作用下表達IL-17。然而，人們發(fā)現(xiàn)這兩種細胞因子組合不會誘導人類CD4+T細胞表達IL-17。通過TCR刺激TGF-β、IL-6、IL-23、IL-21、IL-1β及STAT3信號驅動誘導原始CD4+T細胞分化為Th17細胞產(chǎn)生標志性的細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22以及GM-CSF[31]，促進免疫反應的發(fā)生，也易引起自身免疫性疾病[31，32]。在TGF-β和IL-6誘導下，初始Th17細胞發(fā)生極化。IL-23通過STAT3激活介導的IL-23受體信號進一步調節(jié)Th17細胞極化，為Th17細胞的維持、擴張和正常功能提供一個正反饋通路。近年研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在人類Th17細胞發(fā)育中確實發(fā)揮著至關重要的作用，TGF-β通過SMADS磷酸化誘導RORγt及原始T細胞、IL-23R和IL-1R表達，使其對IL-23和IL-1β敏感；IL-6與其受體IL-6R結合，激活STAT3信號通路和IL-21表達，然后IL-21和IL-6進一步維持RORγt和RORa表達所必需的STAT3信號通路，F(xiàn)oxp3的過表達導致IL-17A的表達降低，IL-6能夠抑制Foxp3的表達，從而間接促進IL-17的表達。IL-21是Th17細胞分泌的一種效應細胞因子，它通過一個自放大環(huán)促進Th17的發(fā)育。相關研究表明，在STAT3激活的細胞因子中，IL-6在小鼠中占據(jù)主導地位，而IL-23在人類Th17細胞中發(fā)揮重要作用，IL-23在小鼠體內與Th17成熟為炎癥細胞有關，既往研究表明，IL-2抑制小鼠體外及體內IL-17表達，其機制作用在IL-2-STAT5信號通路：①STAT5與STAT3競爭結合到IL17a基因位點上；②IL-2抑制IL-6受體表達；③IL-2促進T-bet表達，從而抑制RORγt的表達[33]。然而IL-2可以在體外促進人Th17細胞發(fā)育，此機制目前還有待研究[34]。

1.4.2轉錄因子 RORγt作為維甲酸相關孤兒核激素受體家族是Th17細胞的特異性轉錄因子。RORγt對Th17起主要調節(jié)作用，RORγt直接結合到IL-17A的啟動子區(qū)域，從而調節(jié)其轉錄[35-37]。在RORγt缺失小鼠中IL-17的產(chǎn)生減少，但RORγt的表達本身不足以驅動Th17細胞分化，STAT3激活對IL-17和IL-21的正常表達至關重要[36，37]。在IL-6和TGF-β的共同作用下，STAT3被激活，激活的STAT3誘導RORγt的表達進而促進Th17細胞分化[38]。

1.4.3表觀遺傳修飾 IL-17A啟動子區(qū)域的DNA在原始或Th1細胞中高度甲基化,這些細胞都與IL-17A的非活性狀態(tài)一致[39]。許多研究都提到了DNA甲基化在維持Foxp3基因穩(wěn)定表達與Treg細胞功能相關方面的關鍵作用。最近的研究表明，TET酶家族與TGF-β誘導的Treg細胞中Foxp3的長期表達呈正相關。某些特定分子(如Vitamin c)靶向TET酶，促進5mC氧化為5hmC，這與DNA去甲基誘導的Foxp3基因過表達密切相關[40]。Treg特異性去甲基化區(qū)(TSDR)是Foxp3基因的一個特征性片段。新的證據(jù)證明TSDR只能在穩(wěn)定的Treg細胞表型中被檢測到。研究還發(fā)現(xiàn)，自然Treg細胞中聚集了一個整體去甲基化的輪廓，但效應T細胞除外，顯示TSDR是檢測Treg細胞的有效生物標記物[41]。最近的研究已經(jīng)破譯了一系列的低甲基化基因(Foxp3、Ctla4、Ikzf4和Ikzf2)也受到Foxp3啟動子區(qū)允許的組蛋白修飾的調節(jié)[42-45]。另外研究顯示DNA低甲基化可能增加Foxp3等調控基因的表達[46]。CBP和p300是兩種組蛋白乙酰轉移酶，在穩(wěn)定Treg細胞系和分化方面發(fā)揮了重要作用[47]。組蛋白脫乙酰酶(HDACs)是產(chǎn)生組蛋白脫乙酰的重要酶，當CD4+T細胞缺乏HDAC5時，細胞產(chǎn)生減少，Treg細胞減少[48]。

1.4.4代謝調節(jié) 通過液相色譜和氣象色譜分析表明，Th17 CD4+T細胞中丙酮酸和乳酸水平更高而在Treg細胞亞群中檸檬酸中間體水平更高但長鏈脂肪酸的水平較低，表明了糖酵解、OxPhos和FAO在不同T細胞亞群之間的差異[49]。通過抑制或去除PDH抑制劑PDHK1[丙酮酸脫氫酶(PDH)激酶1]來增加丙酮酸氧化，增加OxPhos產(chǎn)生的ROS水平，選擇性地將Th17 CD4+T細胞的分化轉移到Treg表型[49]。Franchi等[50]發(fā)現(xiàn)Th17細胞體內糖酵解和PDHK1生成的水平更低，體內Th17細胞在產(chǎn)生細胞因子后主要依靠OxPhos。Cdc42是Rho家族的GTPase，是Th17 CD4+T細胞糖酵解的另一修飾因子。Cdc42缺失使得致病Th17 細胞的分化增強，表現(xiàn)為RORγt、IL-17、IL-23R和IFN-γ增加；同時減少Treg發(fā)展和穩(wěn)定降低,并增加對腸道的損傷和炎癥[51]。除了葡萄糖，Th17 CD4+T細胞也可以通過谷氨酰胺分解利用谷氨酰胺作為能量來源。這個過程是由轉錄因子ICER調節(jié),通過控制表達GLS1(一種酶,能夠使谷氨酰胺轉化為谷氨酸和天冬氨酸,隨后轉化為丙酮酸、α酮戊二酸)完成[51]。另外一些信號蛋白和轉錄因子也對Th17細胞反應的代謝變化進行了精細的調控，例如IL-23通過下調清道夫受體CD5L的表達引起Th17細胞致??；Th17 CD4+T細胞利用的生物能途徑也依賴于環(huán)境，并受到環(huán)境因素的影響，高脂肪飲食的小鼠體內Th17 CD4+T細胞的頻率更高，對自身免疫性疾病的易感性也更高，如EAE或DSS誘發(fā)的結腸炎在肥胖小鼠體內加重[52,53]。

1.5Tfh細胞分化機制

1.5.1細胞因子 Tfh細胞是一種新型的輔助T細胞，能夠促進B細胞分化成熟，誘導生發(fā)中心，促進漿細胞和記憶B細胞的成熟[54]。最近研究表明，IL-6、IL-12、IL-21等細胞因子在Tfh細胞發(fā)育中起著至關重要的作用。在小鼠中，IL-6、IL-21通過激活STAT3調節(jié)Tfh細胞，IL-12參與其中的早期過程。而在人體中，IL-12通過激活STAT4促進Bcl-6表達，并且誘導原始CD4+T細胞高表達IL-21、ICOS、CXCR5的作用更加明顯[55，56]。缺乏IL12Rβ1(IL-12受體β1鏈，是IL-12和IL-23的一種常見受體)的受試者顯示出血液中記憶Tfh細胞和記憶B細胞減少以及淋巴結GC形成的改變[56]。另外，TGF-β在人類Tfh分化中也起著重要作用，首先在TGF-β的參與下，IL-12與IL-23通過刺激原始CD4+T細胞促進多種Tfh分子(包括CXCR5、IL-21和Bcl-6)的表達[55，56]；另外TGF-β也通過強烈抑制Blimp-1(一種抑制Bcl-6功能的轉錄抑制因子)的表達促進Tfh的產(chǎn)生[55]。然而在小鼠模型的研究中TGF-β抑制IL-21、ICOS以及Bcl-6的表達[55]；另外，TGF-β通過miR-10a負性調節(jié)影響B(tài)cl-6表達[57]。表明TGF-β的正向調節(jié)可能局限于人體體外研究。

1.5.2轉錄因子 Bcl-6是識別Tfh的標志之一，Bcl-6缺失的CD4+T細胞不能分化為Tfh細胞，提示Bcl-6是Tfh特異性轉錄因子。Bcl-6在Tfh中的強制表達可促進CXCR5、CXCR4和PD-1的表達。一項研究顯示Bcl-6以IL-21和IL-6獨立的方式調控Tfh細胞早期分化。Bcl-6可以與多種遷移相關基因的啟動子和增強子結合(如CCR7、CCR6、CXCR5、CCR4、PD-1、PSGL-1)[58]。Blimp-1在Tfh細胞分化中起拮抗作用，并且是其他效應細胞如Th1、Th2、Th17及Treg的重要轉錄因子。在小鼠研究中，Blimp-1缺失的CD4+T細胞在體內優(yōu)先發(fā)育為Tfh細胞，而Blimp-1表達的CD4+T細胞不能幫助生發(fā)中心的形成。因此，與其他效應細胞由Blimp-1參與調控分化不同，Tfh細胞分化是由Bcl-6調控[59]。此外，Blimp-1表達的同時能夠抑制Bcl-6的表達，表明Bcl-6和Blimp-1是Tfh細胞的拮抗調節(jié)因子。STAT3被發(fā)現(xiàn)對Tfh分化至關重要，小鼠STAT3缺失T細胞中IL-21減少，STAT3突變也減少了體內Tfh細胞的產(chǎn)生[59]。同時，在CD4+T細胞STAT3敲除小鼠中，在KLH免疫后，發(fā)現(xiàn)幾個CXCR5+Tfh細胞有GCs缺陷以及IgG和IgM抗體減少[60]。在STAT3缺失小鼠中，Cxcr5和Icos基因表達下調而Blimp-1的表達上調[61]。更直接的證據(jù)是，STAT3可以與Ikaros鋅指轉錄因子Aiolos形成復合物調節(jié)Bcl-6的表達[62]。如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β對STAT3和STAT4啟動Tfh細胞分化提供了重要信號，強調了STAT3在Tfh細胞發(fā)育中的重要作用。

1.5.3表觀遺傳修飾 Tfh細胞的分化同樣受到表觀遺傳修飾調控。通過DNA去甲基化，與基因位點結合的Bcl-6分別與轉運甲基胞嘧啶雙加氧酶1(TET1：一種羥甲基轉移酶)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)減少有關[63]，而IL-21增加TET2在Bcl-6啟動子區(qū)的富集，從而解釋了狼瘡T細胞中Bcl-6水平的升高[64]。甲基化的H3K27已被報道可以阻止基因表達，而H3K27me3去甲基化酶UTX可以維持細胞和抗體的產(chǎn)生[65]。Tfh細胞的Bcl-6位點檢測到了陽性組蛋白修飾，但其他Th亞群的Bcl-6位點則是陰性標記。在Tfh細胞中，miR-17-92簇下調，這可能導致Bcl-6的過度表達，而miR-155能調節(jié)miR-146a缺陷小鼠Tfh細胞的積累，導致Tfh細胞的異常積累[66]。miR-146a可直接靶向ICOS，miR-146a的丟失介導ICOS的過度表達導致Tfh細胞的自發(fā)和自主積累[67]。越來越多的證據(jù)表明，Tfh細胞具有可塑性，這可以通過表觀遺傳調控來解釋。

1.6Th22細胞分化機制

1.6.1細胞因子 Th22細胞是一類參與固有免疫和適應性免疫的新型輔助T細胞。Th22細胞最初在2009年被發(fā)現(xiàn)，能夠分泌多種細胞因子，最重要的是IL-22。另一方面，Th22細胞可以表達趨化因子受體CCR4、CCR6、CCR10和成纖維細胞生長因子亞型。Th22細胞不表達IL-17、IFN-γ和IL-4等細胞因子[68]，在人類中，細胞因子IL-23、IL-12、IL-6及TNF-α促進IL-22的表達，而TGF-β抑制其表達，這可能歸因于TGF-β激活的轉錄因子c-Maf的抑制功能[69]。

1.6.2轉錄因子 如上所述，Th22細胞不表達IFN-γ、IL-17及IL-4等細胞因子，也不表達T-bet(Th1相關轉錄因子)、GATA3(Th2相關轉錄因子)，僅表達少量RORγt(Th17相關轉錄因子)，然而，轉染RORγt并不促進人類CD4+T細胞表達IL-22。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種獨特的轉錄因子芳烴受體(AHR)介導Th22細胞的發(fā)育[70]。研究表明，刺激AHR可以通過notch信號促進IL-22產(chǎn)生[71]。

1.6.3表觀遺傳修飾 當前關于表觀遺傳修飾調控Th22細胞分化的研究還沒有一個明確的進展，有待深入研究，挖掘之間的相互關系，從而為Th22細胞分化調控機制的多方面了解提供基礎，為Th22細胞在自身免疫性疾病的發(fā)病機制研究提供幫助。

1.7Treg細胞分化機制

1.7.1細胞因子 Treg細胞的作用是限制免疫反應，從而防止自身免疫和其他有害的免疫反應。根據(jù)起源不同，Treg被分成兩個不同的子集，包括自然Treg(nTreg)細胞和適應性Treg(iTreg)細胞，nTreg細胞來自胸腺，iTreg細胞來自外周T細胞。胸腺發(fā)育依賴于TCR聯(lián)合CD28共刺激，CD28對周圍nTreg穩(wěn)態(tài)增殖和存活也至關重要。相比之下，iTreg的發(fā)展需要IL-2和TGF-β參與。TGF-β信號轉導磷酸化激活轉錄因子SMAD2和SMAD3，然后與Foxp3位點結合，誘導Foxp3基因的表達，促進Treg細胞分化；IL-2信號磷酸化STAT5，STAT5與Foxp3位點結合，誘導Foxp3表達，維持Treg細胞的穩(wěn)定。

1.7.2轉錄因子 Foxp3是Treg的重要轉錄因子，對維持Treg的功能和譜系特征至關重要。Foxp3的轉錄能夠被STAT5激活，IL-2激活的STAT5通過直接與Foxp3基因結合并誘導其表達，在維持Treg分化過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β減少Foxp3基因中關鍵CpG島甲基化，從而使Foxp3的表達增加。另外Foxp3可以綁定并阻止RORγt功能，進而減少Th17細胞的發(fā)展。RUNX1通過與Foxp3結合促進誘導Treg，形成RUNX1/Foxp3復合物維持Foxp3表達。在缺乏Foxp3的情況下，RUNX1和RORγt相互作用占據(jù)優(yōu)勢，增強Th17細胞分化和IL-17表達。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)一些轉錄因子可以通過作用于Foxp3基因調節(jié)Treg表達。NF-κB家族成員c-Rel綁定到Foxp3啟動子上一個保守的非編碼序列CNS3，促進Foxp3基因的表達。NFAT和SMAD3是誘導Foxp3基因表達并調控CD4+CD25+Treg分化的關鍵轉錄因子，兩者都是Foxp3增強子區(qū)域組蛋白乙?；虵oxp3表達誘導的重要因素。轉錄因子BACH2作為免疫激活的廣泛調節(jié)因子，幫助維持Treg細胞，同時抑制與CD4+T細胞其他效應群分化相關的基因[72，73]，缺失BACH2的情況下，Treg細胞的FOXP3表達數(shù)量減少[73]。Nr4a核受體也被證明對Treg細胞的發(fā)育至關重要，Nr4a核受體激活Foxp3啟動子[74]，Nr4a缺陷小鼠由于嚴重的自身免疫而早亡。GATA-3通過直接結合和促進Foxp3基因順式調控元件的活性來控制Foxp3的表達[75]。轉錄因子ETS-1可與Foxp3內含子增強子相互作用，是nTreg細胞發(fā)育所必需的[76]。

1.7.3表觀遺傳修飾 與Tconv細胞相比,Treg細胞具有獨特的增強子結構和DNA甲基化模式，它與Tconv細胞共享大多數(shù)活性增強子和DNA低甲基化區(qū)域，但只有少數(shù)Treg特征基因周圍被發(fā)現(xiàn)是Treg細胞特異性的，如Foxp3、Il2ra和Ctla4[77,78]。通過研究tTreg細胞發(fā)育過程中的階段特異性表觀遺傳學變化，證明了大部分Treg特異性增強子，特別是在Foxp3被表達之前，與許多Treg特征基因相關的Treg特異性超增強子(Treg-SEs)在前體階段逐漸平行激活[77]。激活Treg-SE的一個重要因素是基因組組織者Satb1，Satb1缺乏的CD25+Foxp3-CD4SP胸腺細胞分化為Treg細胞的失敗均提示Satb1依賴性增強子的激活對tTreg細胞的發(fā)育至關重要，它與另一種啟動增強子的酶MLL4共同占據(jù)Foxp3位點上新發(fā)現(xiàn)的保守增強子區(qū)CNS0，從而影響Treg細胞分化[77,78]。Tet2和Tet3已經(jīng)被證明可以控制DNA的去甲基化，但在現(xiàn)階段不是Foxp3誘導所必需的[40]。

1.7.4代謝調節(jié) 由于mTORC1活性升高，新近分離的人類Treg具有高糖酵解潛能，AMPK磷酸化水平低，對TCR刺激反應遲鈍。這種失能狀態(tài)由依賴mTOR的瘦素產(chǎn)生來維持，能夠限制Treg細胞功能[79]。在被激活的小鼠Treg細胞中，F(xiàn)oxp3通過抑制糖酵解和促進乳酸向丙酮酸的氧化來誘導向OxPhos的轉移[80]。Treg的遷移依賴于CD28信號誘導的糖酵解，通過mTORC2上調葡萄糖激酶(GCK)。GCK或Rictor的缺失破壞了Treg細胞向皮膚移植物的遷移，導致移植物排斥[81]。Treg特異性Cdc42的缺失也導致糖酵解和脂肪酸氧化相關基因的增加，從而減少了Treg的誘導發(fā)育[82]。Treg細胞在谷氨酰胺缺乏的情況下迅速成長，F(xiàn)oxp3+細胞中mTORC1活性的破壞導致抑制功能的喪失和嚴重的自身免疫性疾?。籖aptor缺陷Treg表現(xiàn)為膽固醇和脂質生物合成的減少，從而干擾了Treg的抑制活性。肉堿棕櫚酰轉移酶-1 (CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶，在Tregs中也有高表達，阻斷CPT1會損害體外Treg分化[79]。丁酸鹽是由共生體微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，通過抑制組蛋白去乙?；?，增加Foxp3位點組蛋白乙?；剑瑥亩С煮w內外Treg的生成。缺乏LKB1的Tregs表現(xiàn)為抑制功能減弱、氧化磷酸化電位降低和ROS生成減少，呈現(xiàn)典型的與Th17 CD4+T細胞相關的代謝特征[83，84]。

2 T細胞分化與疾病進展

CD4+T細胞在保護機體免受病原體侵害方面起著核心作用，但同時它們也參與炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病。多發(fā)性硬化癥是一種自身免疫性疾病，其發(fā)生發(fā)展的確切發(fā)病機制尚不明確，但CD4+T細胞在MS的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。既往,MS被認為是Th1介導的免疫性疾病,最近的研究表明Th17細胞在MS和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病機制中起著關鍵作用，同時Treg通過改善自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著保護作用[85]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種潛在的危及生命的自身免疫性疾病，SLE患者Tfh細胞和Th17細胞較多，支持自身抗體的產(chǎn)生，參與促炎環(huán)境，導致先天免疫細胞引起組織損傷；而Treg細胞較少。因此，抑制TFH和Th17細胞的功能，促進Treg細胞的功能，可能會恢復SLE個體的免疫平衡。自身免疫性溶血性貧血(AIHA)是由抗紅細胞自身抗體對紅細胞破壞增加引起的；Th17細胞被認為是AIHA發(fā)展的關鍵效應因子，Th17細胞增加，IL-17分泌增加與AIHA患者的疾病活動密切相關。中和AIHA大鼠模型體內IL-17可消除發(fā)病[86]。再生障礙性貧血(AA)是一種骨髓造血干細胞減少，導致外周血細胞減少。目前認為T細胞介導的自體免疫失衡是導致獲得性AA發(fā)生的主要原因。炎癥性腸病(IBD)是一組復雜的疾病，CD4+T細胞被認為是炎癥性腸病(IBD)的主要驅動因素，在腸道炎癥,IFN-γ結合另一個Th1相關細胞因子TNF,推動腸道上皮細胞β連環(huán)蛋白信號,限制他們的分化和增殖[87]。

3 T細胞亞群分化與藥物研發(fā)的關系

利用Th1和Th17細胞因子在抗髓過氧化物酶腎小球腎炎不同階段的基因表達可進行相適宜的單克隆抗體治療[88]。相關研究證明，由5種益生菌混合而成的IRT5益生菌可通過降低致病性細胞因子的產(chǎn)生抑制Th1和Th17細胞在周圍免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用并增加IL-10的表達從而對EAE起到改善作用[89]。青蒿素-羥基氯喹聯(lián)合治療通過降低Th2和Th17細胞分化程度并且升高Th1和Treg細胞分化程度調節(jié)大鼠CD4+T細胞亞群的分化從而減輕IgA腎病大鼠腎臟損傷[90]。另外研究表明，給予活動期SLE患者低劑量重組人白介素-2可增加Treg細胞數(shù)量，提高其功能；并且減少Tfh、Th17數(shù)量，降低其功能來降低SLE疾病活性[91]。在EAE小鼠模型中，使用PDHK1抑制劑(DCA)治療可通過減少浸潤到脊髓的CD4+T細胞數(shù)量和增加引流淋巴結中的Treg細胞數(shù)量來改善疾病嚴重程度[92]。

4 總結

CD4+T細胞分化為多個亞群需要一系列因素調控，包括細胞因子、細胞特異性轉錄因子、表觀遺傳修飾及代謝的多因素表達。在這里，我們討論了Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg和Tfh細胞中輔助T細胞分化網(wǎng)絡。深入研究細胞因子、轉錄因子、表觀遺傳學及代謝對Th細胞分化的調控機制，有助于對輔助T細胞更深層次的了解，并探討不同亞群分化對自身免疫性疾病的影響，針對Th細胞亞群分化調節(jié)機制的藥物研發(fā)，從而有助于開發(fā)新的疾病治療方法，為解決當代自身免疫性疾病提供思路。