人羊膜細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用①

程亞偉 羅 熠 王諾鑫 肖建輝

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，遵義市醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563003 )

近年來(lái)，從人羊膜分離的羊膜細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。人羊膜細(xì)胞除了具備干細(xì)胞的多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)特性外，還具有獲取方便、無(wú)侵入性操作損傷、無(wú)倫理道德問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的細(xì)胞來(lái)源。2007年，第一屆胎盤來(lái)源干細(xì)胞的國(guó)際研討會(huì)明確了胎盤可獲取干細(xì)胞的4個(gè)區(qū)域、細(xì)胞類型、分離方法及基本特征，其中人羊膜細(xì)胞包括人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)和人羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stromal cells,hAMSCs)[1]。hAECs表達(dá)CD324、CD29、CD73、CD136、SSEA-4和OCT-4，不表達(dá)CD14和CD45；hAMSCs表達(dá)經(jīng)典的間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD44、CD73和CD105[1]。更重要的是，hAECs和hAMSCs均低表達(dá)HLA-A，B，C，不表達(dá)HLA-DR[1]，表明這兩種細(xì)胞具有免疫豁免特性，移植入體內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng)。

羊膜具有維持胎兒耐受母體免疫的特性，能夠抑制固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]。事實(shí)上，hAECs和hAMSCs在臨床前研究中，已經(jīng)取得了良好的疾病治療效果[3-6]。關(guān)于干細(xì)胞如何促進(jìn)受損組織修復(fù)和再生的研究很多，其中一種理論認(rèn)為，移植入體內(nèi)的細(xì)胞通過(guò)分化為特定類型細(xì)胞來(lái)替換受損組織[7,8]。然而，移植入體內(nèi)的羊膜細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞歸巢至受損組織且存活，但仍有良好的治療效果[9,10]。這些發(fā)現(xiàn)改變了羊膜細(xì)胞基于分化為特定類型細(xì)胞替換受損組織的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到羊膜細(xì)胞具有改善受體免疫微環(huán)境的能力。

在炎癥持續(xù)惡化的疾病中，抑制炎癥發(fā)展是治療疾病的必要條件。研究表明，有些干細(xì)胞分泌的生物活性介質(zhì)能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制損傷后激活的免疫反應(yīng)以促進(jìn)受損組織的修復(fù)和再生[11-13]。目前，hAECs和hAMSCs已廣泛應(yīng)用于治療炎癥性疾病模型，如肝纖維化、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、自身免疫性腦脊髓炎等[3,6,9,14,15]。這些研究在不同的疾病模型中均取得了令人鼓舞的治療效果，為人羊膜細(xì)胞用于炎癥性疾病的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。人羊膜細(xì)胞在炎癥性疾病治療中涉及的免疫調(diào)節(jié)主要包括兩個(gè)方面：對(duì)免疫細(xì)胞自身演化及增殖的影響和對(duì)免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)(圖1)。為此，本文就人羊膜細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響進(jìn)行了綜述。

1 免疫系統(tǒng)的基本功能

機(jī)體免疫系統(tǒng)除了具有識(shí)別和清除外來(lái)抗原外，還能監(jiān)控體內(nèi)突變的腫瘤細(xì)胞、衰老細(xì)胞和其他有害成分。此外，免疫系統(tǒng)也有助于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[16]。但是，當(dāng)機(jī)體的免疫平衡被打破時(shí)，可以觸發(fā)慢性和急性炎癥。例如，當(dāng)免疫系統(tǒng)失去區(qū)分潛在有害的外來(lái)抗原和自身抗原的能力時(shí)，就可能引起自身免疫反應(yīng)。據(jù)估計(jì)，自身免疫性疾病，如1型糖尿病、炎癥性腸病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，影響全球人口的7.6%～9.4%[17]。除自身免疫反應(yīng)外，免疫系統(tǒng)在細(xì)胞、器官以及組織工程構(gòu)建體移植中也起著重要作用。因此，基于人羊膜細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性，能夠干預(yù)免疫應(yīng)答過(guò)程以達(dá)到治療效果，對(duì)于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)免疫介導(dǎo)的炎癥性反應(yīng)至關(guān)重要。

2 人羊膜細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響

2.1人羊膜細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的影響 在炎癥發(fā)展過(guò)程中，中性粒細(xì)胞首先游離到炎癥部位，其可持續(xù)釋放氧化劑和蛋白酶，導(dǎo)致宿主組織持續(xù)性炎癥和損傷不愈。因此，減少中性粒細(xì)胞向損傷部位遷移，及時(shí)清除炎癥部位的中性粒細(xì)胞，對(duì)損傷修復(fù)至關(guān)重要。在HSV-1誘導(dǎo)的小鼠角膜炎模型中，人羊膜移植能減少中性粒細(xì)胞的趨化和活化水平，并促進(jìn)浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞的凋亡和巨噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬作用，降低角膜基質(zhì)部位炎性因子IL-2、TNF-α、IL-1α以及趨化因子CXCL1水平[18]。有研究表明，hAECs能減少中性粒細(xì)胞向肺內(nèi)浸潤(rùn)[19]，并通過(guò)表達(dá)FasL介導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡[20]。而且，凋亡的中性粒細(xì)胞還能釋放含有Annexin-1的微粒，這是一種對(duì)中性粒細(xì)胞具有抗遷移作用的蛋白[21]。因此，中性粒細(xì)胞凋亡可以進(jìn)一步抑制中性粒細(xì)胞的遷移和募集。

中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)的過(guò)量釋放與自身免疫性和慢性炎癥性疾病的發(fā)展有關(guān)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，hAMSCs能釋放TSG-6蛋白，參與抑制中性粒細(xì)胞釋放活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NETs，從而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)[23]。Nicholls等[24]利用流式細(xì)胞術(shù)與免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)hAMSCs高表達(dá)CD200。CD200與其受體結(jié)合，具有抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞功能，以及促進(jìn)原始T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)[25]。并且，將hAMSCs移植入大鼠腦缺血性損傷模型中，能增加大鼠體內(nèi)抗炎因子TGF-β和IL-10的水平，減少促炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α及趨化因子MCP-1和GRO-α的表達(dá)，從而緩解大鼠的腦缺血性損傷。有趣的是，缺氧環(huán)境能進(jìn)一步增強(qiáng)hAMSCs緩解大鼠腦缺血性損傷的效果[24]。這些研究結(jié)果提示，人羊膜細(xì)胞能夠以中性粒細(xì)胞為靶標(biāo)，抑制中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移和活化，促進(jìn)其凋亡，減輕炎癥的發(fā)生發(fā)展。

2.2人羊膜細(xì)胞對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的影響 抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)，如樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)、單核/巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞在機(jī)體炎癥過(guò)程中被募集到炎癥部位，對(duì)免疫識(shí)別和應(yīng)答起重要調(diào)控作用。APC功能的抑制，不僅能減輕由APC引起的炎癥刺激，還能減少免疫細(xì)胞向炎癥部位的趨化，抑制免疫反應(yīng)的進(jìn)一步激活。有研究表明，人羊膜細(xì)胞可以抑制APC的招募和成熟。在多發(fā)性硬化小鼠模型中，移植hAECs可以減少單核/巨噬細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)，緩解疾病的進(jìn)程[9]。將人羊膜細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，能顯著抑制DC成熟標(biāo)志物CD83和CD1a的表達(dá)，減少促炎性因子IL-8、CXCL9、MAP-1α、IL-12p40和IL-12p70的水平，增加抗炎因子IL-10、MIC-1和PGE2的分泌[26,27]。值得注意的是，不同的微環(huán)境也能影響hAMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力。如Pianta等[28]發(fā)現(xiàn)，子癇患者的hAMSCs和正常hAMSCs均能抑制單核細(xì)胞向DC和M1-型細(xì)胞方向分化，減輕炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步激活，然而，來(lái)自子癇患者的hAMSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)效果。

2.3人羊膜細(xì)胞對(duì)單核吞噬細(xì)胞的影響 單核吞噬細(xì)胞包括血液中的單核細(xì)胞和組織器官中的巨噬細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，極化的巨噬細(xì)胞通常被稱為M1-和M2-巨噬細(xì)胞，是兩種主要且功能相反活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。其中，M1-巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和ROS來(lái)協(xié)調(diào)炎癥期，消除損傷的起始因素；M2-巨噬細(xì)胞能夠縮短炎癥期，促進(jìn)組織形成與修復(fù)[29]。諸多研究表明，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的增殖和分化是人羊膜細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)和改善治療效果的關(guān)鍵因素。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，將hAECs或hAMSCs與單核細(xì)胞共培養(yǎng)(細(xì)胞接觸或Transwell培養(yǎng))，均能改變單核細(xì)胞的分化方向，并使具有抗炎效應(yīng)的細(xì)胞因子分泌增加。并且，與Transwell培養(yǎng)相比，細(xì)胞接觸培養(yǎng)對(duì)單核細(xì)胞的影響更強(qiáng)[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，hAMSCs能通過(guò)抑制MAPKs和NF-κB信號(hào)通路，減少脂多糖(lipopolysacchride,LPS)刺激的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β[30]。此外，hAMSCs還能抑制其向M1-巨噬細(xì)胞分化，促進(jìn)其向M2型轉(zhuǎn)化[28]，從而減輕炎癥反應(yīng)。而且，單核細(xì)胞與hAMSCs共培養(yǎng)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞具有抑制T細(xì)胞增殖，使T細(xì)胞分泌的顆粒酶B減少的功能[31]。不僅如此，hAMSCs的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)還能促使小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞向M2-巨噬細(xì)胞分化，表現(xiàn)為高表達(dá)抗炎因子IL-10和TGF-β1以及低分泌促炎因子IL-12、TNF-α、RANTES和NO[31]。

人羊膜細(xì)胞不僅能改變單核細(xì)胞分化，同時(shí)在體內(nèi)能抑制巨噬細(xì)胞向炎癥部位遷移。研究表明，hAECs能通過(guò)分泌免疫抑制因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[20]。并且，將hAECs、hAMSCs及其CM注射入LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型體內(nèi)，能減少巨噬細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)，降低肺纖維化[32,33]，這與小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、LIF和趨化因子MCP-1和MIP-2的分泌水平降低，以及抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、PGE2的分泌水平升高有關(guān)。此外，在傷口愈合模型中，注射hAMSCs-CM能誘導(dǎo)M1向M2型轉(zhuǎn)換，增強(qiáng)M2-巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)組織修復(fù)再生[31]。

2.4人羊膜細(xì)胞對(duì)自然殺傷細(xì)胞的影響 人羊膜細(xì)胞對(duì)自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)也有一定的影響。Li等[34]報(bào)道hAECs和hAMSCs呈劑量依賴模式抑制NK的殺傷能力。這與人羊膜細(xì)胞抑制NK受體(NKp30，NKp44，NKp46，NKG2D，CD69)活化有關(guān)。有趣的是，這種效應(yīng)是可逆的，因?yàn)樵谝瞥搜蚰ぜ?xì)胞后連續(xù)培養(yǎng)能恢復(fù)NK細(xì)胞毒活性。人羊膜細(xì)胞抑制NK的細(xì)胞毒活性，與其旁分泌產(chǎn)生的PGE2和IL-10有一定關(guān)系[34]。在單核細(xì)胞向DC分化過(guò)程中，hAECs能增加單核細(xì)胞表面免疫抑制分子HLA-G的表達(dá)[27]，而HLA-G表達(dá)的增加可增強(qiáng)對(duì)NK細(xì)胞毒活性的抑制[35]。

2.5人羊膜細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響 T細(xì)胞具有高度特異性，根據(jù)表面標(biāo)志物和功能特征，可分為不同亞群，各亞群對(duì)急慢性炎癥和自身免疫反應(yīng)起著不同的調(diào)控作用。其中Treg在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。研究表明，人羊膜細(xì)胞能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖/活化影響免疫反應(yīng)。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，將人羊膜細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，能明顯降低T細(xì)胞增殖[36-39]。并且，隨著人羊膜細(xì)胞數(shù)量與T細(xì)胞比值增加，其對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)越強(qiáng)[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人羊膜細(xì)胞不僅能影響T細(xì)胞的增殖，也能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的成熟/活化。Pianta等[28]發(fā)現(xiàn)，將hAMSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)，能抑制T細(xì)胞增殖，同時(shí)使T細(xì)胞偏向Treg亞群活化。有趣的是，用IFN-γ處理hAMSCs后，能增強(qiáng)其對(duì)T細(xì)胞的抗增殖作用[38]，說(shuō)明不同的微環(huán)境能影響人羊膜細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。近來(lái)，Laranjeira等[40]證明，對(duì)于不同的T細(xì)胞亞群(初始T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞和中央型記憶T細(xì)胞)，人羊膜提取物均具有抗增殖作用，并能減少CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生顆粒酶B、穿孔素、NKG2D等，增加表達(dá)IL-10和FoxP3的T細(xì)胞比率。另外，hAMSCs-CM能抑制T細(xì)胞向Th1和Th17亞群分化，下調(diào)Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-1β，以及Th17細(xì)胞因子IL-17和IL-22的表達(dá)[39]。就人羊膜細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖及分化能力，可能與其自身旁分泌的IDO、PGE2、TGF-β、HGF等可溶性細(xì)胞因子有密切關(guān)系[11,12]。

在體內(nèi)，人羊膜細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用與體外保持一致。例如，在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[14]和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎[37]模型中，人羊膜細(xì)胞能選擇性下調(diào)體內(nèi)Th1和Th17亞群比例，增加Treg亞群比例，恢復(fù)Th1/Th2和Th17/Treg比值，從而降低疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。

這些研究證明，人羊膜細(xì)胞能夠以T細(xì)胞為靶標(biāo)，抑制自身?yè)p傷性炎癥反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)的作用。這表明人羊膜細(xì)胞在治療移植物抗宿主病、自身免疫性疾病等方面具有先天優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

損傷后激活的免疫反應(yīng)是把雙刃劍，異常的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生，合理抑制損傷部位的免疫反應(yīng)，對(duì)組織再生與修復(fù)至關(guān)重要。體外和臨床前動(dòng)物模型的研究表明，人羊膜細(xì)胞具有強(qiáng)烈抑制先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特性，并在炎癥發(fā)展的不同階段均能抑制免疫細(xì)胞活性，誘導(dǎo)外周免疫耐受，逆轉(zhuǎn)炎性損傷。因此，人羊膜細(xì)胞在炎癥性疾病、移植物抗宿主病等疾病的治療方面表現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。但是，目前的研究尚未完成臨床試驗(yàn)，并且，有研究表明人羊膜細(xì)胞在體內(nèi)外均具有一定的免疫刺激作用[41,42]。因此，進(jìn)一步了解人羊膜細(xì)胞的作用機(jī)制，特別是它們?nèi)绾闻c微環(huán)境相互作用，以及如何重建機(jī)體免疫平衡是實(shí)現(xiàn)人羊膜細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。