神經(jīng)血管單元在缺血性腦水腫中作用機(jī)制和中藥對(duì)其治療的研究進(jìn)展

田方澤，宋文婷，姚明江，徐 立，任鈞國(guó)，王 敏，劉建勛

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100019;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029)

缺血性腦水腫主要發(fā)生在病程急性期，發(fā)病快，逐步形成大腦不可恢復(fù)性損傷，是急性期致殘、致死的最重要原因[1]。神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)是由神經(jīng)元—膠質(zhì)細(xì)胞—血管構(gòu)成，其概念的提出，使得不同原因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞的損傷被視為大腦所有細(xì)胞和基質(zhì)共同參與的組織損傷反應(yīng)過程，其作為神經(jīng)系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)，也為缺血性腦水腫的研究帶來了新亮點(diǎn)。對(duì)于缺血性腦水腫，一直以來是以腦血管內(nèi)皮細(xì)胞為主要的研究靶細(xì)胞，NVU是以整體觀來評(píng)估各種細(xì)胞在腦水腫發(fā)病過程當(dāng)中的病理變化和及對(duì)血腦屏障的影響作用[2]。研究表明，中藥以多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在缺血性腦病急性期，同時(shí)減輕腦水腫和梗死區(qū)的損傷程度，為治療缺血性腦水腫提供了很好的思路和方法。因此了解缺血性腦水腫在NVU水平中的病理生理機(jī)制和中藥對(duì)其的治療作用是非常重要的。

1 內(nèi)皮細(xì)胞

1.1 內(nèi)皮細(xì)胞與血腦屏障(blood brain barrier，BBB)血管功能障礙幾乎涉及每一個(gè)神經(jīng)病理學(xué)中的環(huán)節(jié)，其中包括神經(jīng)慢性疾病和急性中風(fēng)等。其中血液供應(yīng)的喪失不僅影響神經(jīng)元，而且影響脈管系統(tǒng)本身，從而導(dǎo)致BBB功能的喪失。

1.1.1內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接(tight junction，TJ) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的TJ限制了BBB中的水溶性物質(zhì)從血液到大腦的擴(kuò)散。在分子水平上，TJ由特異性跨膜蛋白組成，通過輔助細(xì)胞質(zhì)蛋白與基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架相連(Zona occludens，ZO)系列(ZO-1，ZO-2和ZO-3)，使TJ形成緊密密封，同時(shí)保持快速調(diào)節(jié)能力。Occludin和claudins是TJ的主要跨膜蛋白成分。claudins形成TJ的密封作用，而occludin則作為額外的支持結(jié)構(gòu)。

1.1.2內(nèi)皮細(xì)胞腫脹 雖然受缺血嚴(yán)重影響的區(qū)域經(jīng)常表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性損失，但梗塞區(qū)域邊緣區(qū)域的缺血血管主要表現(xiàn)出內(nèi)皮水腫的跡象。這種現(xiàn)象最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并持續(xù)造成血管損傷。此外，觀察到缺血影響的血管的改變可能是缺血影響NVU的關(guān)鍵特征，并且隨著缺血時(shí)間的增加，其具有出血性轉(zhuǎn)化和腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。

有研究表明，缺血誘導(dǎo)早期時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，在內(nèi)皮水腫先于缺血相關(guān)的BBB分解，并促進(jìn)內(nèi)皮完整性的進(jìn)一步喪失[3]。在此過程中，血管退化可能最終增加出血性轉(zhuǎn)化和顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)。因此缺血影響的NVU(包括內(nèi)皮功能障礙)被稱為中風(fēng)研究的重中之重。

1.2 中藥在內(nèi)皮細(xì)胞的導(dǎo)致缺血性腦水腫的治療進(jìn)展在臨床上，采用西醫(yī)溶栓類藥物結(jié)合中醫(yī)益氣治療方法，比單獨(dú)使用西醫(yī)療法更能緩解腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)患者的愈后致殘率和腦水腫的損傷。其中注射用丹參多酚酸，主要功能是減輕腦水腫，改善血腦屏障功能。臨床上心腦血管的常用藥血塞通，其主要成分為三七總皂苷。Zhang等[4]對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)血塞通可以改善出血后的腦水腫，加速腦血腫的吸收并且抑制炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

對(duì)眾多健脾益氣的方劑研究后發(fā)現(xiàn)，加味四君子湯通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)保護(hù)和升高了血腦屏障的緊密連接ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)，從而減輕了腦水腫[5]。七葉皂苷是治療外傷性水腫的主要藥物，其主要的作用機(jī)制是保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善血液循環(huán)[6]。聯(lián)合七葉皂苷和地塞米松比單獨(dú)使用地塞米松，更能減少腦水腫體積，減輕一氧化氮和內(nèi)皮素-1，ICAM-1，在抗炎、改善內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)上起到減輕水腫的作用[7]。

清熱解毒類藥物中，發(fā)現(xiàn)益氣解毒方可以減輕血腦屏障的損傷，減輕腦水腫，改善腦部微循環(huán)。平肝熄風(fēng)類藥物中發(fā)現(xiàn)，地龍水提取物能明顯改善CIR后大腦的皮層水腫，降低IL-1β、TNF-α 等炎癥因子和內(nèi)皮細(xì)胞功能[8]。

2 星形膠質(zhì)細(xì)胞

細(xì)胞毒性水腫是一種缺血性腦水腫前病變過程，其中細(xì)胞由于滲透物(主要是Na+和Cl-)的流入而膨脹，并且水從間隙流入細(xì)胞內(nèi)隔室。該過程發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后的細(xì)胞類型中，并且在星形膠質(zhì)細(xì)胞中特別突出。所以研究腦水腫中星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用尤為關(guān)鍵[9]。

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞與血腦屏障最新的研究證據(jù)表明，在不同發(fā)病階段，星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生因子對(duì)于BBB破壞和恢復(fù)都大為關(guān)鍵。

2.1.1星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)BBB的破壞作用

(1) 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factors，VEGFs)：盡管VEGF在CNS中的各種類型的細(xì)胞中產(chǎn)生，但在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到VEGF參與了BBB破壞。有研究報(bào)道了小鼠腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中VEGF-A表達(dá)的增加，并且使用抗體阻斷VEGF-A減輕了BBB的破壞[10]。在患有腦損傷，包括腦外傷和缺血性中風(fēng)的病人中，觀察到VEGF水平的增加與其病情的嚴(yán)重程度有很大的關(guān)系。(2) 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)：MMP具有降解內(nèi)皮TJ相關(guān)蛋白和ECM分子的功能。許淑紅等[11]發(fā)現(xiàn)MMP-9的過表達(dá)導(dǎo)致Claudin-5和Occludin的降解，導(dǎo)致內(nèi)皮屏障破壞，在腦缺血/灌注的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，MMP誘導(dǎo)的TJ相關(guān)蛋白的減少導(dǎo)致BBB破壞。其中BBB損害會(huì)進(jìn)一步加劇惡化并出現(xiàn)腦內(nèi)出血。(3) 谷氨酸(glutamate，GLT)：由于腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放過量的谷氨酸，星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的谷氨酸必須通過激活內(nèi)皮谷氨酸受體參與BBB破壞。過量的谷氨酸通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體改變的血管通透性， 在大鼠永久性局灶性腦缺血后，阻斷此受體減弱BBB破壞。Andras等[12]研究表明，調(diào)整谷氨酸的含量可降低腦內(nèi)皮細(xì)胞中Occludin蛋白的水平。

2.1.2星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生因子對(duì)BBB的保護(hù)

(1) 血管生成素-1(angiopoietin-1，ANG-1)：一系列研究發(fā)現(xiàn)ANG-1對(duì)BBB功能具有保護(hù)作用。ANG-1的過表達(dá)減少血腦屏障滲漏，同時(shí)在局灶性栓塞腦缺血的動(dòng)物模型中，外源性ANG-1可以抑制BBB損傷[13]。 (2) Sonic hedgehog重組蛋白(SHH)：SHH對(duì)減少BBB破壞的有益作用也已得到證實(shí)。重組SHH的使用減少了永久性缺血模型大鼠的BBB滲漏。此外，Alvarez等[14]研究顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的SHH通過內(nèi)皮細(xì)胞hedgehog通路促進(jìn)BBB形成和完整性。(3) 神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial derived neurotrophic factor，GDNF)：先前報(bào)道GDNF可以促進(jìn)血管生成，增加Claudin-5表達(dá)和加強(qiáng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。Xiao等[15]也證實(shí)了GDNF對(duì)Occludin和ZO-1的上調(diào)。這些結(jié)果意味著GDNF通過增加內(nèi)皮細(xì)胞中的TJ相關(guān)蛋白而對(duì)BBB破壞發(fā)揮保護(hù)作用。

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹細(xì)胞毒性水腫(細(xì)胞腫脹)發(fā)生在CNS損傷后的所有細(xì)胞類型中，并且在星形膠質(zhì)細(xì)胞中特別突出。同時(shí)，細(xì)胞毒性水腫的產(chǎn)生了導(dǎo)致血管源性水腫的發(fā)生與惡化。

2.2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞與水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4) 有研究表明，體外AQP4敲除的星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出較慢的水腫脹程度， 而AQP4的過度表達(dá)導(dǎo)致更快的腫脹，AQP4可能在介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞體積的動(dòng)態(tài)變化中起作用[16]。同時(shí)，在誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹后，AQP4表達(dá)的增加與星形膠質(zhì)細(xì)胞體積隨時(shí)間的增加呈正相關(guān)。

2.2.2瞬時(shí)受體電位香草酸4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4) TRPV4在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)最高，特別是在星形膠質(zhì)細(xì)胞末端。TRPV4信號(hào)通道對(duì)多個(gè)物理刺激比較敏感，包括溫度和壓力/細(xì)胞腫脹。激活的TRPV4通道導(dǎo)致Ca2+流入，隨后水通過AQP4通道流動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞體積減少。因此，提出通過TRPV4通道的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹誘導(dǎo)的Ca2+流入作為細(xì)胞體積減少的觸發(fā)因子[17]。

2.3 中藥對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致缺血性腦水腫的治療進(jìn)展活血化瘀類藥物中，有研究表明，七葉皂苷不僅能改善內(nèi)皮環(huán)境，同時(shí)也能抑制MMP-9和AQP4的表達(dá)，從而降低血管基底膜的分解，增加血腦屏障的通透性，發(fā)揮了中藥多途徑多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[7]。三七總皂苷對(duì)緩解腦水腫方面也做出了貢獻(xiàn)，三七總皂苷能改善由凝血酶和炎性反應(yīng)兩方面導(dǎo)致的出血性腦水腫，同時(shí)，三七總皂苷可以降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減輕腦水腫的損害，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用[18]。在新清開靈注射液的研究中發(fā)現(xiàn)，在腦出血72 h后，新清開靈組大鼠腦含水量明顯低于模型組，有可能是通過減輕MMP9，提高SOD活性，降低炎性反應(yīng)相關(guān)[19]。

利水滲濕類藥物中，五苓散作為傷寒名方，廣泛用于各類水液代謝障礙的疾病中，其中減輕腦水腫可能是通過減少AQP4，同時(shí)提高Na+-K+-ATP酶的活性而發(fā)揮作用[20]。番瀉苷A作為SHH的抑制劑和斑蝥素以及鈣離子的拮抗劑聯(lián)合使用能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白的張力，從而通過降低星形膠質(zhì)細(xì)胞體積腫脹來治療腦水腫[21]。

3 小膠質(zhì)細(xì)胞

3.1 小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血性水腫的影響在急性卒中期間，小膠質(zhì)細(xì)胞激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞凋亡，在局部缺血或出血的幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)破壞血管和內(nèi)皮組織[2]。

經(jīng)典的Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)是BBB的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)于穩(wěn)定腦內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接至關(guān)重要[22]。其作用的發(fā)揮可能是通過激活核內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α)，調(diào)控VEGF的表達(dá)，從而改善BBB的穩(wěn)定性。

TREK-1是新發(fā)現(xiàn)的雙孔結(jié)構(gòu)域的鉀通道成員，其有助于泄漏K+電流并調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。有研究表明，TREK-1缺乏與體內(nèi)ICH后的BBB功能障礙有關(guān)，其機(jī)制可能是由鈣調(diào)蛋白上調(diào)介導(dǎo)的。

3.2 中藥對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致缺血性水腫的研究進(jìn)展近年來，中藥通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性水腫損傷中發(fā)揮了積極的作用。白術(shù)內(nèi)酯可以抑制缺血性小鼠腦水腫，恢復(fù)腦血流量，在原發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制炎性因子和JAK2/STAT3通路的表達(dá)，其作用和AG490(JAK2抑制劑)相似。其次，丹皮酚對(duì)亞急性/慢性腦缺血具有保護(hù)作用，在造模后72 h可抑制腦水腫和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[23]。在青藤堿的研究中發(fā)現(xiàn)，其能減輕大腦中動(dòng)脈阻塞腦梗死和腦水腫，其可能是通過AMPK途徑抑制NLRP3炎性小體而發(fā)揮作用的[24]。梔子苷和人參皂苷Rg1尾靜脈注射可以改善中動(dòng)脈閉塞大鼠24 h腦水腫體積和CD11b的表達(dá)，同時(shí)可以抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)下BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞miR-155-5p的表達(dá)。

4 周細(xì)胞

周細(xì)胞有助于BBB在成年大腦發(fā)育中的形成和維持，同時(shí)有助于中風(fēng)后內(nèi)皮細(xì)胞的存活和BBB保護(hù)。在暴露于缺氧條件下的內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，周細(xì)胞增強(qiáng)了屏障功能并保護(hù)內(nèi)皮單層免于缺氧損傷。已顯示周細(xì)胞在局灶性腦缺血或全腦缺血后2h內(nèi)從腦微血管中脫離[25]。這種脫離表明周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用和細(xì)胞間接觸也被破壞，導(dǎo)致BBB分解。

此外，周細(xì)胞衍生的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、3和9，可導(dǎo)致緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能丟失。因此，周細(xì)胞和周細(xì)胞衍生因子的分離通過跨細(xì)胞促進(jìn)BBB破壞并加速中風(fēng)惡化。

國(guó)內(nèi)外暫時(shí)都未有周細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和BBB影響的研究，且還未有針對(duì)周細(xì)胞來緩解缺血性水腫的中、西藥物，這一空白可能將會(huì)在以后的研究中得以填補(bǔ)。

5 總結(jié)

在缺血性腦水腫發(fā)病的進(jìn)展中，內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦周細(xì)胞，主要在炎癥反應(yīng)、BBB的損傷和保護(hù)、谷氨酸毒性、離子通道和水通道蛋白中發(fā)揮主要的作用。因?yàn)槟X水腫發(fā)病原因的復(fù)雜性，病程過程不是單一因素，而是多因素、多細(xì)胞參與了缺血性腦水腫的病程發(fā)展，所以治療缺血性腦水腫的藥物應(yīng)從整體觀著手，結(jié)合NUV特點(diǎn)，多靶點(diǎn)、多細(xì)胞共同調(diào)節(jié)。

現(xiàn)在對(duì)于缺血性腦水腫的藥物研究也出現(xiàn)了很多亮點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了一系列中藥復(fù)方和單體對(duì)其有明顯的療效，主要依據(jù)中醫(yī)理論“益氣健脾”和“活血清熱”等。 但是也存在一系列問題：(1)在治療急性中風(fēng)中藥治療中，很少有目的明確的降低缺血性腦水腫的治療藥物，降低腦水腫不能作為核心的研究目的，只是作為中藥評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一。(2)中藥復(fù)方在急性期給藥的劑型局限性，復(fù)方藥物給藥方式的優(yōu)化，尤其是注射劑的提純和優(yōu)化方面，需要做到突破。