小花清風(fēng)藤中黃酮類(lèi)成分的研究

潘國(guó)吉孫慶文徐文芬柏彩紅劉夢(mèng)鴿陸 祥張 葉

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)550025）

小花清風(fēng)藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.屬于清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物，為貴州省2003 年版《中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 收載品種。國(guó)內(nèi)主要分布于貴州西南部、云南東南部至西南部、廣西西部及西南部［1］。在貴州西南地區(qū)，苗族、布依族用小花清風(fēng)藤的莖藤治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷痛、肝炎等［2-3］。通過(guò)查閱整理相關(guān)的文獻(xiàn)資料可知，小花清風(fēng)藤中主要含有五環(huán)三萜類(lèi)［4-7］、生物堿類(lèi)［8-10］、黃酮類(lèi)［11-12］和揮發(fā)油類(lèi)［13］等。其中黃酮類(lèi)化合物具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、抗炎及抑菌抗病毒等藥理作用，極有可能是該藥材發(fā)揮藥效作用的成分類(lèi)群之一。而小花清風(fēng)藤藥材現(xiàn)報(bào)道的黃酮類(lèi)成分僅有蘆丁、槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素等，因大多數(shù)藥材均含有以上幾種黃酮類(lèi)成分，選擇其作為該藥材質(zhì)量控制指標(biāo)缺乏專(zhuān)屬性，難于客觀評(píng)價(jià)藥材的優(yōu)劣。鑒于此，本研究結(jié)合多種色譜分離技術(shù)，進(jìn)一步挖掘小花清風(fēng)藤藥材中黃酮類(lèi)成分，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎且具有生物活性的黃酮類(lèi)化合物，為建立該藥材多指標(biāo)質(zhì)量控制方法及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料

WNMR-Ⅰ600 MHz 核磁共振波譜儀（中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所）；超高壓液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Therom Ultimate -3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；分析和半制備型高效液相色譜儀為Agilent 1100 型（美國(guó)Agilent 公司）；RE-5210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化有限公司）；BuchiR-215 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；AG135 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

實(shí)驗(yàn)藥材于2017 年6 月采自貴州省鎮(zhèn)寧縣，原植物經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物小花清風(fēng)藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.，植物憑證標(biāo)本（P-201708001）保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

將自然干燥的小花清風(fēng)藤莖和葉（11.22 kg），經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，得粗粉（10.8 kg），用甲醇回流提取3 次（2 h ／次），合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，加水溶解，上樣于D-101 大孔樹(shù)脂，依次用25%、70%、100%甲醇溶液洗脫，濃縮，干燥，得浸膏（25% 甲醇洗脫部位0.75 kg、70% 甲醇洗脫部位1.67 kg 和100% 甲醇洗脫部位1.17 kg）。取適量70%甲醇洗脫部位浸膏經(jīng)硅膠色譜柱分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得2 個(gè)組分Fr.1-1～1-2。Fr.1-1 過(guò)硅膠色譜柱，經(jīng)二氯甲烷-甲醇（20∶1～4）洗脫，再經(jīng)制備HPLC 甲醇-水（60∶40）得化合物5（46 mg）、6（62 mg）、7（41 mg）；Fr.1-2 經(jīng)ODSA-HG 反相色譜柱，甲醇-水（3∶7）洗脫，得組分Fr.1-2-1 和Fr.1-2-2。Fr.1-2-1 經(jīng)制備HPLC 甲醇-水（60∶40）洗脫，得化合物3（137 mg）、4（89 mg），F(xiàn)r.1-2-2 經(jīng)制備HPLC 甲醇-水（50∶50）洗脫，得化合物1（59 mg）、2（153 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：649.4 ［M＋Na］＋、625.3［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）。相對(duì)分子量626，分子式C27H30O17。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），7.56（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz，H-6′），6.84（1H，d，J＝8.8 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.17（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.40（1H，d，J＝7.2 Hz，Glu H-1），4.06（1H，d，J＝7.8 Hz，Glu H-1）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.4（C-2），133.3（C-3），177.3（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.5（C-7），93.7（C-8），156.3（C-9），104.0（C-10），121.1（C-1′），115.3（C-2′），144.8（C-3′），148.6（C-4′），116.2（C-5′），121.7（C-6′），100.9（Glu C-1），73.4（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），68.1（Glu C-6），103.1（Glu C-1），74.0（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.7（Glu C-4），76.4（Glu C-5），60.7（Glu 5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14-15］基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-龍膽雙糖苷。

化合物2：黃色粉末，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：765.1 ［M＋Na］＋、741.3 ［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量742，分子式C32H38O20。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.70（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），7.62（1H，dd，J＝12.0，2 Hz，H-6′），6.36（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），4.55（1H，d，J＝1.0 Hz，Rha H-1），4.38（1H，d，J＝7.5 Hz，Xyl H-1），1.13（3H，d，J＝5.9 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.2（C-2），135.5（C-3），179.1（C-4），162.7（C-5），100.3（C-6），166.6（C-7），95.2（C-8），158.5（C-9），105.3（C-10），123.1（C-1′），117.8（C-2′），145.7（C-3′），149.7（C-4′），116.1（C-5′），123.5（C-6′），104.7（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.9（Glu C-6），102.3（Rha C-1），71.5（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.4（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.4（Xyl C-1），75.2（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］基本一致，故鑒定為camellianoside。

化合物3：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：632.9 ［M＋Na］＋、609.4 ［M-H］-，UV λmax 為256 nm（帶Ⅱ），355 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量610，分子式C27H30O16。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.62（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.35（1H，s，H-8），6.17（1H，s，H-6），5.11（1H，d，J＝7.4 Hz，Glu H-1），4.55（1H，Rha H-1），1.14（3H，d，J＝6.3 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：158.3（C-2），135.6（C-3），179.2（C-4），162.7（C-5），99.9（C-6），165.8（C-7），94.9（C-8），159.2（C-9），105.5（C-10），123.6（C-1′），117.7（C-2′），145.6（C-3′），149.7（C-4′），116.0（C-5′），123.1（C-6′），104.7（Glu C-1），73.9（Glu C-2），78.1（Glu C-3），69.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.5（Glu C-6），102.3（Rha C-1），72.2（Rha C-2），72.0（Rha C-3），75.7（Rha C-4），71.3（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］基本一致，故鑒定為蘆丁。

化合物4：棕色結(jié)晶，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：749.1 ［M＋Na］＋、725.2 ［M-H］-，UV λmax 為265 nm（帶Ⅱ），346 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量726，分子式C32H38O19。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.07（1H，s，H-6′），8.04（1H，s，H-2′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-3′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.19（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.11（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.52（1H，d，J＝1.6 Hz，Rha H-1），4.34（1H，d，J＝7.4 Hz，Xyl H-1），1.11（3H，d，J＝6.0 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.4（C-2），135.4（C-3），179.2（C-4），162.9（C-5），100.1（C-6），166.1（C-7），95.1（C-8），158.5（C-9），105.6（C-10），122.7（C-1′），132.4（C-2′），116.1（C-3′），161.4（C-4′），116.1（C-5′），132.4（C-6′），104.5（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.7（Glu C-4），77.1（Glu C-5），69.0（Glu C-6），102.2（Rha C-1），71.7（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.5（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.3（Xyl C-1），75.3（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］基本一致，故鑒定為tsubakioside A。

化合物5：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：616.8 ［M＋Na］＋、592.7 ［M-H］-，UV λmax 為265 nm（帶Ⅱ），346 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量594，分子式C27H30O15。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.56（1H，s，5-OH）10，10.85（1H，s，7-OH），10.13（1H，s，4′-OH），7.98（1H，m，H-2′，6′），6.88（1H，m，H-3′，5′），6.88（1H，d，J＝8.9 Hz，），6.41（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.31（1H，d，J＝7.6 Hz，Glu H-1），4.，37（1H，d，J＝1.5 Hz，Rha H-1），0.98（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.9（C-2），133.3（C-3），177.4（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.1（C-7），93.8（C-8），156.5（C-9），104.0（C-10），120.9（C-1′），130.9（C-2′），115.1（C-3′），159.9（C-4′），115.1（C-5′），130.9（C-6′），101.4（Glu C-1），74.2（Glu C-2），75.8（Glu C-3），71.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），66.9（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.6（Rha C-2），70.4（Rha C-3），71.8（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.8（Rha 5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］基本一致，故鑒定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

化合物6：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：647.4 ［M＋Na］＋、623.0 ［M-H］-，UV λmax 為257 nm（帶Ⅱ），357 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量624，分子式C28H32O16。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2′），6.85（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5′），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-8），6.35（1H，d，J＝2.3 Hz，H-6），5.35（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.37（1H，d，J＝1.2 Hz，Rha H-1），3.85（3H，s，3′-OCH3），0.97（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：157.0（C-2），133.6（C-3），177.6（C-4），160.9（C-5），98.0（C-6），165.2（C-7），92.3（C-8），156.5（C-9），105.1（C-10），121.2（C-1′），115.3（C-2′），144.9（C-3′），148.6（C-4′），116.5（C-5′），121.8（C-6′），101.2（Glu C-1），74.1（Glu C-2），76.1（Glu C-3），70.2（Glu C-4），76.5（Glu C-5），67.1（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.5（Rha C-2），70.7（Rha C-3），71.9（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.83（Rha 5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］基本一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

化合物7：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性；ESI-MSm／z：309.2 ［M＋Na］＋、285.1 ［M-H］-，UV λmax 為266 nm（帶Ⅱ），366 nm（帶Ⅰ）；相對(duì)分子量286，分子式C15H10O6。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.06（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-2′，H-6′），6.89（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-3′，H-5′），6.42（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：147.0（C-2），137.1（C-3），177.3（C-4），160.5（C-5），99.2（C-6），163.8（C-7），93.4（C-8），156.2（C-9），103.2（C-10），121.7（C-1′），130.0（C-2′），116.3（C-3′），169.5（C-4′），116.3（C-5′），130.0（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］基本一致，故鑒定為山柰酚。

4 討論

通過(guò)多種色譜和光譜技術(shù)相結(jié)合，從小花清風(fēng)藤中分離得到7 個(gè)黃酮類(lèi)化合物，其中有5 個(gè)化合物（1～2、4～6）為首次從該植物中分離得到。研究結(jié)果豐富了小花清風(fēng)藤藥材的化學(xué)成分，以期為完善2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種小花清風(fēng)藤藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為小花清風(fēng)藤藥材綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。