疾病相關小膠質(zhì)細胞在阿爾茲海默癥發(fā)病中的作用研究

崔雨沙,路 欣,李 峰

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院2016 級五年制臨床醫(yī)學專業(yè),北京 100069；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗教學中心形態(tài)學實驗室,北京 100069；3.首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系,北京腦重大疾病研究院,北京神經(jīng)再生修復研究重點實驗室,北京 100069)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種年齡相關的的神經(jīng)退行性疾病,組織學表現(xiàn)為Aβ斑塊沉淀以及神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)炎癥的形成[1]。AD 患者危險基因位點很大一部分位于小膠質(zhì)細胞[2],如Trem2、Apoe 等；而小膠質(zhì)細胞是大腦主要的免疫細胞,與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生息息相關。以往對小膠質(zhì)細胞的研究大多采用M1、M2 分型的方式對其功能進行解釋[3]。 但隨著現(xiàn)在技術的進步,如全基因組測序、表觀遺傳學分析等,我們對小膠質(zhì)細胞和疾病的認識更加深入和全面,這一分型已經(jīng)不能滿足我們的需求。 利用單細胞測序等方法,從細胞轉(zhuǎn)錄組角度,最近發(fā)現(xiàn)了一種新的小膠質(zhì)細胞亞型——疾病相關的小膠質(zhì)細胞(disease associated microglia,DAM),它在AD 晚期擔任著重要的保護作用,為AD 疾病的治療帶來了新的曙光。本文綜述了近年來小膠質(zhì)細胞在AD 發(fā)病中的研究進展,特別從小膠質(zhì)細胞的分型進行歸納總結,以期對廣大研究工作者更多啟發(fā)。

1 小膠質(zhì)細胞在正常狀態(tài)和AD 疾病中的作用

小膠質(zhì)細胞大約占人類大腦所有細胞的0.5%到16.6%,是大腦中最主要的免疫細胞,起源于胚胎七到八天的原始骨髓祖細胞,由卵黃囊分化而來,和循環(huán)系統(tǒng)的單核細胞相互獨立[4]。 正常狀態(tài)下,小膠質(zhì)細胞可以在沒有外周造血細胞輸入的情況下進行自我更新并且保持固有數(shù)量[5]。 作為大腦中的免疫細胞,小膠質(zhì)細胞主要通過表面的受體不斷感受周邊的病原體、凋亡神經(jīng)元等刺激,從而做出相應反應,起到維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能。它也有許多不同于吞噬細胞的功能,如修剪突觸、促進神經(jīng)元再生、組織軸突的投射等[3],對于大腦的發(fā)育至關重要。 AD 疾病狀態(tài)時,小膠質(zhì)細胞會被激活,激活的小膠質(zhì)細胞主要有兩方面的作用,一方面參與炎癥反應,在Aβ 刺激下使NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子活化,從而引起一系列炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生炎癥因子如IL-1β、TNFα[6]等,介導炎癥反應；另一方面小膠質(zhì)細胞可以介導Aβ 的吞噬,減少Aβ 沉積[7],還可以通過Trem2 形成小膠質(zhì)細胞屏障[8],最終減少Aβ 對AD 病人的危害,延緩病情發(fā)展。 隨著疾病的分期不同,小膠質(zhì)細胞起的作用亦不相同。 AD 的疾病病程主要可以被分為三期,AD 初期為Aβ 斑塊的形成期,這一期小膠質(zhì)細胞可以通過炎癥小體NLRP3 中的ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)來協(xié)助Aβ 蛋白聚集以及在大腦中播散,并且產(chǎn)生一些炎癥因子來促進Aβ 斑塊的形成,因此在這一期的炎癥反應主要為有害的作用；AD 中期為Aβ 斑塊沉積期,這一期Aβ 斑塊增加,小膠質(zhì)細胞通過Trem2 介導形成小膠質(zhì)細胞屏障來抑制Aβ 斑塊的擴散,防止其毒害周圍的神經(jīng)元,起著神經(jīng)保護性的作用；AD 末期為TAU 蛋白沉積、Aβ 蛋白達到穩(wěn)定的時期,這一期神經(jīng)元的死亡增加,活化的小膠質(zhì)細胞在清除死亡神經(jīng)元的過程中誘導了炎癥反應以及星形膠質(zhì)細胞的活化,造成更多神經(jīng)元的死亡,形成一個惡性循壞[9]。

2 傳統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞分型——M1、M2 型小膠質(zhì)細胞

為了解釋小膠質(zhì)細胞的復雜功能,傳統(tǒng)觀念把小膠質(zhì)細胞分為M1、M2 兩型,而這一分型最初是從外周吞噬細胞分型借用來的。 研究者們發(fā)現(xiàn)吞噬細胞在T 細胞分泌的兩種炎癥因子IFNγ 和IL-4的誘導下,會產(chǎn)生兩種完全不同的細胞表型:M1 和M2 型,它們的表面標志物以及功能都不相同,反映了吞噬細胞在多種免疫環(huán)境下可以產(chǎn)生不同的表型來發(fā)揮作用。 但小膠質(zhì)細胞作為大腦特有的免疫細胞,它的來源、生存環(huán)境、結構特點以及所發(fā)揮的作用都和吞噬細胞不一致,因此,簡單地把吞噬細胞分型引入到小膠質(zhì)細胞是不科學的。 為了驗證這一觀點,我們使用單細胞RNA 測序的方法去分析腦部創(chuàng)傷模型小鼠大腦中的小膠質(zhì)細胞,結果確實無法找到只表達M1 型或M2 型標志基因的小膠質(zhì)細胞[3]。 所以,M1、M2 型小膠質(zhì)細胞并沒有轉(zhuǎn)錄譜以及其他科學依據(jù)的支持,這一分型的合理性值得懷疑。 為了克服其局限性,我們需要尋找一個新的、合理的小膠質(zhì)細胞分型,來指導我們接下來的道路。

3 一種新的小膠質(zhì)細胞類型——疾病相關小膠質(zhì)細胞

脫離原有利用細胞標志物來對小膠質(zhì)細胞進行分型的思路,最近的單細胞RNA 測序技術幫助我們客觀地認識免疫細胞的類型及其狀態(tài),提供了一個從轉(zhuǎn)錄組方面定義細胞類型的新工具。 利用此方法,2017 年Keren-Shaul 等[10]發(fā)表的文獻介紹了在阿爾茲海默癥5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的一種AD 小鼠特有的小膠質(zhì)細胞——疾病相關小膠質(zhì)細胞(DAM),它在這一疾病模型的病理晚期特異性的出現(xiàn)而不在野生型小鼠中出現(xiàn),主要標志物為CD9、CD11、Clec7a 和CD63,定位于Aβ 斑塊附近。Keren-Shaul 等[10]的研究發(fā)現(xiàn),與穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞相比,DAM 有著截然不同的基因型,出現(xiàn)一些基因的下調(diào)如Cx3cr1；也有一些基因的上調(diào)如Apoe、Lpl、CD9、Cst7、Trem2,是一種新的小膠質(zhì)細胞類型。DAM 高表達脂代謝和吞噬相關基因,可以吞噬Aβ蛋白,幫助大腦清除Aβ 沉積,起保護性作用。 但在AD 后期,由于Aβ 活化了炎癥小體,而炎癥小體的ASC 可以協(xié)助Aβ 斑塊的沉積[10],DAM 反而會加速病情發(fā)展。 除5XFAD 小鼠,在其他神經(jīng)退行性病變小鼠模型如ALS、APP 小鼠也有DAM 的存在[11],但這些DAM 是否為同一種小膠質(zhì)細胞,還需要進一步的探究。

DAM 主要由凋亡的神經(jīng)元和髓鞘碎片等誘導產(chǎn)生,磷脂酰絲氨酸為DAM 識別凋亡細胞的靶點[12]。 這些可以誘導DAM 產(chǎn)生的物質(zhì),有學者把它 們 稱 為 神 經(jīng) 變 性 相 關 分 子 模 式( neurodegeneration-associated molecular patterns,NAMP),類似于外周誘導吞噬細胞活化的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),包括死亡神經(jīng)細胞凋亡體、髓鞘碎片、脂類降解產(chǎn)物、神經(jīng)退行性疾病和衰老所形成的細胞外蛋白聚集(如Aβ)等。 識別NAMP 需要DAM 上相應的受體,如Trem2、TAM(Tyro3/Axl/Mer)、嘌呤受體P2Y12,它們分別介導不同的功能[13]。 對于這些受體的深入研究,可以幫助我們更好的理解DAM在AD 及其他神經(jīng)退行性病變中的作用。

3.1 DAM 的分型

小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)退行性疾病中的作用是多方面的,疾病晚期的小膠質(zhì)細胞亦然。 Rangaraju等[14]2018 年發(fā)表的文獻以CD11b 為主要標志物篩選疾病晚期的小膠質(zhì)細胞,然后通過整合小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集和驗證研究,發(fā)現(xiàn)了促炎和抗炎兩類小膠質(zhì)細胞。 其中抗炎的小膠質(zhì)細胞以CD44、CD45 和CD274 為標志,主要富集參與碳水化合物和脂質(zhì)代謝、膽固醇外排、抗原呈遞、氧化還原酶活性和衰老/自噬的胞漿蛋白相關基因,可以被NFkB、Stat1、P53 和RelA 調(diào)控；促炎的小膠質(zhì)細胞以CXCR4 為標志,主要富集促炎功能相關基因,包括免疫信號、細胞增殖、粘附、抗原呈遞、鈣內(nèi)流和細胞因子的產(chǎn)生等,可以被LXRα/β 和Atf-1 調(diào)控。這兩類小膠質(zhì)細胞高表達DAM 的特征基因,在阿爾茲海默癥5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠分離的DAM 中,也可以根據(jù)細胞標志找到這兩類小膠質(zhì)細胞,因此,這兩類小膠質(zhì)細胞為DAM 的兩個亞型,分別命名為促炎DAM 和抗炎DAM。 這兩個DAM 亞型均在Trem2 的下游出現(xiàn),抑制Trem2 后便不會產(chǎn)生這兩種小膠質(zhì)細胞亞型[14]。

但是DAM 為病理晚期出現(xiàn)的小膠質(zhì)細胞類型,無法解釋小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組隨著時間是如何變化的。 為了探查不同疾病時期小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組,Mathys 等[15]的研究對AD 小鼠模型不同病理階段的小膠質(zhì)細胞分別進行了單細胞RNA 測序及分析。 文獻結果表明在病理早期的小膠質(zhì)細胞高表達DNA 復制和修復以及細胞周期相關的基因,其上調(diào)的基因主要與細胞增殖分裂相關,小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)退行性病變中的增殖反應主要在這一階段完成；而病理晚期的小膠質(zhì)細胞上調(diào)的基因主要為免疫反應相關的基因。 病理晚期的小膠質(zhì)細胞按照轉(zhuǎn)錄組的不同又可以分為兩類,一類為1 型干擾素誘導的基因模塊,調(diào)控抗病毒和干擾素應答反應,主要與神經(jīng)元的DNA 損傷有關,神經(jīng)元DNA 的損傷可以誘導出此類小膠質(zhì)細胞；一類為2 型干擾素誘導的MHC II 類基因模塊,主要以T 細胞非依賴的方式發(fā)揮作用,可以放大神經(jīng)退行性病變的癥狀[15]。 比較這一分型中病理早期小膠質(zhì)細胞與DAM 基因的異同,發(fā)現(xiàn)病理早期小膠質(zhì)細胞的基因與DAM 相似性不高。 而病理晚期小膠質(zhì)細胞基因變化與DAM 大致相同:在DAM 上調(diào)的278 個基因中,202 個都在病理晚期的小膠質(zhì)細胞中上調(diào)。 但是許多抗病毒和干擾素反應相關的基因在病理晚期的小膠質(zhì)細胞中上調(diào)而不在DAM 中上調(diào)[15]。 關于病理晚期的小膠質(zhì)細胞在疾病中是起一個保護性還是傷害性或中立性的作用,目前還不清楚,需要進一步的探究。

3.2 DAM 相關的關鍵位點

3.2.1 Trem2 和DAM

Trem2 是AD 的一個主要風險基因,基于單細胞測序的研究發(fā)現(xiàn),Trem2 可以決定DAM 表型的出現(xiàn)。穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細胞通過兩步變?yōu)镈AM:第一步為不依賴于Trem2 的過程,在這一步穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞的關卡基因如Cx3cr1 和P2ry12/P2ry13 下調(diào),而一些AD相關的基因如B2m、Apoe 上調(diào),小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g態(tài)DAM；第二步為依賴Trem2 的過程,小膠質(zhì)細胞Trem2 高表達,吞噬和脂代謝相關的基因如Cst7 和Lpl 高表達,轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K的DAM[16]。 關于Trem2 介導DAM 轉(zhuǎn)型的具體機制,有研究發(fā)現(xiàn)Trem2 可以通過激活mTOR 通路來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的代謝,促進小膠質(zhì)細胞的生長增殖。 如果敲除Trem2,mTOR 會被抑制,而長期的mTOR 缺陷會導致整體小膠質(zhì)細胞功能障礙、細胞存活率和增殖率降低。 因此Trem2 可能是通過維持第一步活化的小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)以及生存狀態(tài)來實現(xiàn)第二步的轉(zhuǎn)變的[17],而不是通過介導一種新的基因型的變化。

3.2.2 APOE 和DAM

APOE 是一種能夠結合和運輸膽固醇以及脂質(zhì)的蛋白,在人類有APOE2、APOE3、APOE4 三種亞型。 其中APOE4 的純合子可以使AD 的發(fā)病率提高12 倍；APOE2 則可以延遲遺傳性AD 的發(fā)病年齡；APOE3 與AD 發(fā)病無明顯相關性。 APOE 在穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細胞中表達量很低,但在DAM 中APOE表達卻大幅增加,是DAM 中表達量上調(diào)幅度最大的基因之一。 用凋亡的神經(jīng)元去激活小膠質(zhì)細胞,可以通過Trem2 誘導出APOE 的活化,進而調(diào)控APP-PS1 和SOD1 小鼠中小膠質(zhì)細胞的類型轉(zhuǎn)換,使小膠質(zhì)細胞向DAM 的方向轉(zhuǎn)變,形成促進DAM轉(zhuǎn)型的Trem2-APOE 軸；若把APOE 或Trem2 敲除,小膠質(zhì)細胞便不會向DAM 方向轉(zhuǎn)變[18]。 從亞型的層面研究APOE,發(fā)現(xiàn)APOE4 的表達可以使小膠質(zhì)細胞對于受傷的神經(jīng)元有更高的攻擊性,促進靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镈AM,所以在TREM2-APOE軸起主要作用的APOE 亞型可能為APOE4[19]。

3.2.3 IRF1、LXRβ 和CEBPα

在促炎和抗炎DAM 發(fā)現(xiàn)之后,有研究對小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡分析,確定了幾個可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞類型轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄因子,分別為CEBPα、IRF1 和LXRβ。 CEBPα、IRF1 和LXRβ 都可以調(diào)節(jié)DAM 的核心基因如Apoe、Axl、Clec7a、Tyrobp 和Trem2,很大程度上決定了穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞向DAM 的轉(zhuǎn)型。 其中IRF1 調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞、促炎DAM、抗炎DAM 三個模塊的基因,在小膠質(zhì)細胞反應中起雙重作用；CEBPα 和LXRβ 則主要調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞和抗炎DAM 的基因,起保護作用。 除了調(diào)節(jié)促炎和抗炎DAM 表型,CEBPα、IRF1 和LXRβ 還可以下調(diào)小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)元突觸修剪相關的基因,而IRF1 和LXRβ 可以上調(diào)吞噬相關的基因,增強小膠質(zhì)細胞對Aβ 的吞噬,因此IRF1 和LXRβ 可能通過介導從穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞的突觸修剪功能向AD 的吞噬清除功能的轉(zhuǎn)變,來促進促炎DAM 表型的生成[20]。

3.2.4 其他DAM 危險基因

除上述位點外,還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多其他與DAM相關的危險位點。 (1)CD33 和TYROBP/DAP12 分別為Trem2 上游和下游的分子,且在DAM 中表達量大幅增加[14]。 (2)膜受體ABCA7、Tyro3/Axl/Mer(TAM)、CX3CR1 與P2Y12 等分別可以結合Aβ 蛋白、凋亡神經(jīng)元、補體與細胞外ADP 等,對于DAM的功能至關重要。 (3)細胞激酶RIPK1 可以介導一部分小膠質(zhì)細胞的基因變化,促使小膠質(zhì)細胞向DAM 的轉(zhuǎn)型[21]。 (4)基因分析發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)節(jié)DAM 表型的基因,其中Apoe, Hla-dqa1 可以促進促炎DAM 的表達；Ms4a4e, Hla-dqb1 和Treml2 促進抗炎DAM 表達；Bin1, Cnn2,Picalm 和Sorl1 促進穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞基因表達[14]。 (5)許多基因的變異可以增加疾病發(fā)生的風險如TYROBP、GRN 等,另一些基因如MS4A6A、PLCG2、PICALM 等的變異則可以對疾病起保護性作用,而這些基因都與DAM有很強的相關性,在DAM 中的表達量與穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞相比差異顯著[13]。

4 研究展望

顯然,從轉(zhuǎn)錄組學方面對小膠質(zhì)細胞進行全面分析,構建小膠質(zhì)細胞分型可以擺脫傳統(tǒng)細胞分型的局限,更加全面和科學的認識小膠質(zhì)細胞在疾病中的作用。 但這一分型體系研究仍在初始階段,對于小膠質(zhì)細胞在不同時期是如何被誘導為特異的亞型、不同亞型的小膠質(zhì)細胞所承擔的具體作用,以及這些分型中所預測到的AD 危險位點所介導的作用都尚未清楚,因此,關于DAM 的相關研究仍需深入,以期對AD 開辟新的診治思路。