骨骼肌時鐘基因與生理功能及活動研究進展

黃增浩 康良 胡毓詩 劉沛潔 丁海麗，

1 成都體育學院運動醫(yī)學與健康學院（成都610041）

2 成都體育學院運動醫(yī)學與健康研究所（成都610041）

近些年來，時間生物學已經(jīng)發(fā)展成為一個廣泛而高度活躍的研究領(lǐng)域，具有時鐘性質(zhì)的組織按照調(diào)控機能等級可分為中樞時鐘（central clocks）和外周時鐘（peripheral clocks）。在哺乳動物中，位于下丘腦視交叉上核的中樞時鐘通過神經(jīng)元與內(nèi)分泌途徑調(diào)控周圍組織的外周時鐘，這種晝夜節(jié)律全身同步歸功于時鐘基因之間相互作用。時鐘基因在許多生理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，包括參與新陳代謝、能量穩(wěn)態(tài)及睡眠覺醒等。骨骼肌作為外周組織，其生理功能和活動受到時鐘基因調(diào)控，盡管已有研究證實了骨骼肌在運動和代謝功能中顯示出晝夜節(jié)律，但時鐘基因分子機制在其中的作用尚未被完全認識。本文綜述時鐘基因在骨骼肌中的表達，探討其在維持肌肉質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，參與骨骼肌成肌分化、能量代謝、睡眠、運動等方面的作用，為相關(guān)疾病和肌肉運動能力的時間調(diào)節(jié)機制提供參考。

1 時鐘基因概述

時鐘基因是晝夜節(jié)律核心調(diào)節(jié)因子，其可使生物體適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生約24 小時周期變化，并調(diào)控體溫、激素分泌和運動能力等生理活動[1]。在哺乳動物中，晝夜節(jié)律由一套分級系統(tǒng)組成[2]，包括位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）中樞時鐘及全身器官組織外周時鐘[3]。SCN在晝夜節(jié)律中發(fā)揮核心作用，經(jīng)視網(wǎng)膜下丘腦束（retinohypothalamic tract，RHT）接受來自視網(wǎng)膜神經(jīng)元的光信號傳入，通過神經(jīng)和內(nèi)分泌途徑將節(jié)律投射到外周器官組織，此過程中時鐘基因是確保全身晝夜節(jié)律同步的關(guān)鍵[4]。骨骼肌作為機體外周組織，也受到時鐘基因節(jié)律調(diào)控參與各項生理功能，從而指導生物體與環(huán)境相適應(yīng)[5]。

時鐘基因周期性表達所形成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路（transcriptional-translational feedback loop，TTFL）是晝夜節(jié)律核心分子機制，其包括核心環(huán)路與穩(wěn)定環(huán)路[6]。晝夜時間（circadian time，CT）零時，核心環(huán)路中轉(zhuǎn)錄因子CLOCK（circadian locomoter output cycles pro?tein kaput）和BMAL1（brain and muscle ARNT-like 1）形成異二聚體，通過E-box 調(diào)控序列驅(qū)動時鐘基因Period（Per）和Cryptochrome（Cry）表達[7]；隨后PER 與CRY 蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，在細胞核中不斷積蓄并反饋抑制其自身表達；在CT12到CT24期間，Per和Cry的mRNA 水平下降，現(xiàn)有PER-CRY 復(fù)合物降解，形成周期約24 小時循環(huán)[8]。穩(wěn)定環(huán)路中核受體RORα（retino?ic acid receptor-related orphan receptors）、REV-ERBα（又稱NR1D1）和REV-ERBβ（又稱NR1D2）由CLOCKBMAL1 異二聚體驅(qū)動表達，而RORα和REV-ERBα/β通過REV 反應(yīng)元件（REV response element，RRE）序列對BMAL1分別起激活和抑制作用[9]。

2 骨骼肌中時鐘基因

骨骼肌在維持機體運動系統(tǒng)及代謝功能中起重要作用。轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中3.4%至16%的基因以晝夜節(jié)律方式表達[10]，如核心分子時鐘基因Bmal1、Rev-erbα和Rev-erbβ；以及分別參與肌生成、脂質(zhì)利用和蛋白質(zhì)代謝基因，Myod1（myogenic differenti?ation 1）、Ucp3（uncoupling protein 3）及Atrogin1（Fbox protein 32）等[11]。故骨骼肌作為外周組織，受到核心時鐘基因及組織特異性節(jié)律基因調(diào)控，由此完成諸多復(fù)雜生理功能，如在人體代謝穩(wěn)態(tài)中，根據(jù)能量供應(yīng)和需求波動，骨骼肌可對底物吸收、儲存、利用和釋放等過程進行嚴密的調(diào)節(jié)。

目前，已有系列研究證明骨骼肌特異性生理功能與晝夜節(jié)律關(guān)系密切[5，12-14]。晝夜節(jié)律紊亂則導致骨骼肌結(jié)構(gòu)功能變化，包括肌纖維結(jié)構(gòu)改變，線粒體代謝減少和胰島素敏感性受損等[15]?；蚯贸Ｐ驮诮沂緯r鐘基因與骨骼肌生理功能關(guān)系中發(fā)揮重要作用，晝夜節(jié)律時鐘基因大都存在亞型而顯示功能冗余，如Cry家族中Cry1、Cry2，若單個基因敲除并不會出現(xiàn)明顯表型變化，而Cry1/2雙重基因敲除才能破壞相應(yīng)基因功能[11]；與Per、Cry及Clock等不同，Bmal1作為一種非冗余時鐘基因，敲除后可導致生物鐘完全紊亂[16]。目前，時鐘基因全身性和組織特異性功能喪失模型已被廣泛用于探究肌肉時鐘功能。

3 時鐘基因與骨骼肌生理功能

骨骼肌中表達的Baml1、Rev-erbα、Clock等時鐘基因不僅可維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定調(diào)節(jié)，而且通過激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路或其他作用途徑，參與調(diào)控骨骼肌生理形成與功能，如維持肌肉質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，參與骨骼肌成肌分化、能量代謝等。

3.1 時鐘基因與骨骼肌質(zhì)量結(jié)構(gòu)

骨骼肌質(zhì)量與肌纖維結(jié)構(gòu)受到時鐘基因調(diào)控。Clock-/-小鼠可致骨骼肌肌絲結(jié)構(gòu)破壞，單個肌纖維肌力水平下降[17]。Rev-erbα通過抑制泛素-蛋白酶體降解途徑中Ubc（ubiquitin）基因、E3泛素連接酶Atrogin-1及MuRF1（Muscle-Specific RING Finger Protein 1）基因，調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量和纖維大小，Rev-erbα-/-小鼠可致骨骼肌質(zhì)量及纖維橫截面積減小[18]。

有研究發(fā)現(xiàn)全身Bmal1-/-小鼠骨骼肌粗細肌絲超微結(jié)構(gòu)破壞，線粒體腫脹、體積減小[19]，在發(fā)育約16 周齡后出現(xiàn)隨時間變化的肌肉質(zhì)量減少現(xiàn)象，表現(xiàn)為肌肉萎縮和肌力水平下降[20]。但在成年小鼠肌肉中特異性敲除Bmal1基因發(fā)現(xiàn)肌絲超微結(jié)構(gòu)正常，并未出現(xiàn)肌肉減少癥狀，肌肉質(zhì)量甚至有所增加[21-23]，肌力水平變化因?qū)嶒灢町惿杏写芯縖19]。推測在發(fā)育過程中非肌肉組織的Bmal1缺失造成過早衰老和肌肉質(zhì)量減少。

由此可見，生物鐘可調(diào)節(jié)骨骼肌質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，但具體途徑尚不明確，是晝夜節(jié)律中斷造成的，還是其他外周組織造成的繼發(fā)效應(yīng)有待進一步探索。

3.2 時鐘基因與骨骼肌成肌分化

骨骼肌在損傷刺激后可導致肌衛(wèi)星細胞激活，并于成肌調(diào)節(jié)因子參與下發(fā)揮再生潛能。Wnt（winglesstype MMTV integration site family）信號通路在成肌細胞增殖、融合和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[24，25]。近些年來圍繞時鐘基因與骨骼肌成肌分化功能開展了相關(guān)研究。

肌源性前體（myogenic precursors，MPC）由肌衛(wèi)星細胞擴增組成，在肌肉損傷后經(jīng)增殖、分化、融合形成新的肌纖維，維持骨骼肌生長和修復(fù)[26]。研究發(fā)現(xiàn)時鐘基因Rev-erbα是MPC 增殖的抑制因子，體外培養(yǎng)中Rev-erbα在肌肉損傷時表達受抑制，而表現(xiàn)出MPC 增殖水平提高，對Rev-erbα-/-小鼠誘導肌肉損傷后也觀察到MPC表達高于野生型的現(xiàn)象[27]。

成肌調(diào)節(jié)因子MYOD 參與MPC 分化過程，同時也受到Wnt 信號通路調(diào)節(jié)[28，29]。有研究推測時鐘基因Bmal1可能經(jīng)MYOD發(fā)揮成肌分化能力，已發(fā)現(xiàn)Bmal1與Clock轉(zhuǎn)錄形成異二聚體可結(jié)合于MYOD啟動子，并使其呈節(jié)律性表達，而MYOD 也可促進Bmal1轉(zhuǎn)錄[30]。但在肌肉特異性Bmal1基因敲除小鼠中卻呈現(xiàn)相反結(jié)果，即MYOD 表達增加，并維持晝夜節(jié)律振蕩[16]。雖有推測MYOD 上調(diào)可能因自發(fā)活動增加所致[22]，但仍需進一步研究Bmal1對骨骼肌成肌分化的影響。

Wnt/β-catenin信號通路參與胚胎肌肉發(fā)育和骨骼肌穩(wěn)態(tài)維持。Bmal1通過轉(zhuǎn)錄激活Wnt 通路相關(guān)因子調(diào)控肌源性分化[26，31]，研究發(fā)現(xiàn)Bmal1-/-小鼠中Wnt 通路基因β-catenin、Tcf3和Wnt靶基因Axin2表達水平下降，使MPC生長和增殖降低，肌生成受損[26]。而Wnt通路激活可部分恢復(fù)Bmal1-/-小鼠肌源性分化[31]，這也提示可能除Wnt通路外，Bmal1通過其他途徑促進成肌分化。Rev-erbα也被認為可能通過Wnt信號下游Ctnnb1基因來調(diào)節(jié)成肌細胞功能[32]，但肌肉中Rev-erbα和Wnt信號通路之間交互作用是否依賴于Bmal1或其他晝夜節(jié)律時鐘基因仍有待確定。

Bmal1與Rev-erbα為代表的骨骼肌時鐘基因在成肌分化中發(fā)揮重要作用，而其他時鐘基因?qū)τ诠趋兰∩L及修復(fù)功能研究仍在進行中。

3.3 時鐘基因與骨骼肌糖、脂代謝

骨骼肌參與全身能量代謝，研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌時鐘可預(yù)期肌肉細胞底物代謝轉(zhuǎn)變[33]。通過進食前調(diào)節(jié)基因激活轉(zhuǎn)錄，提高胰島素敏感性、促進脂質(zhì)儲存和葡萄糖代謝，協(xié)調(diào)抑制脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)分解，完成從禁食階段到攝食階段能量供需周期性變化[34]。

時鐘基因Clock與Bmal1參與葡萄糖轉(zhuǎn)運與代謝。研究發(fā)現(xiàn)在人類原代肌肉細胞培養(yǎng)中，通過siR?NA干擾時鐘基因Clock可使骨骼肌對葡萄糖攝取能力降低[35]。另一方面，肌肉特異性Bmal1敲除小鼠也出現(xiàn)葡萄糖攝取能力下降，肌肉胰島素抵抗[36]，這可能由Rab-GTP 激活蛋白TBC1D1 表達減少，從而使葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）降低所致[16]；Bmal1缺失還可導致丙酮酸脫氫酶受抑制，肌肉糖酵解與葡萄糖氧化部分解偶聯(lián)，糖酵解中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到替代糖、核苷酸、脂質(zhì)和氨基酸合成途徑[22]。

時鐘基因Bmal1與Rev-erbα共同調(diào)控攝食階段前脂質(zhì)代謝，Bmal1依賴性激活Dgat2促進脂質(zhì)合成和儲存，Rev-erbα介導抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)（如Plin5、Acsl1、Ucp3、Pdk4等），共同完成從脂質(zhì)到葡萄糖的代謝底物轉(zhuǎn)變[37]。有研究通過Rev-erbα/β雙重敲除小鼠顯示出循環(huán)葡萄糖和甘油三酯水平升高、游離脂肪酸水平降低，進一步證實Rev-erb調(diào)控脂肪酸氧化代謝[33]。此外，肌肉特異性Bmal1敲除小鼠脂質(zhì)合成受損、脂肪酸氧化能力增強[16]，其機制可能是因Bmal1缺失，使鈣通道中Cacna1s基因表達增加，繼而激活活化T 細 胞 核 因 子（nuclear factor of activated T cell，NFAT），鈣-NFAT軸可提高氧化能力[38]。

上述研究提示，骨骼肌時鐘基因相互協(xié)作以預(yù)期底物代謝轉(zhuǎn)變，但與其他代謝組織（如肝臟、脂肪組織）如何在節(jié)律上保持同步尚缺乏研究。

4 骨骼肌時鐘基因與生理活動

時鐘基因不僅與骨骼肌生理功能密切相關(guān)，而且可經(jīng)晝夜節(jié)律變化調(diào)控機體諸多生理活動。已有研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌時鐘基因可影響睡眠及運動。

4.1 骨骼肌時鐘基因與睡眠

時鐘基因參與調(diào)節(jié)睡眠穩(wěn)態(tài)，骨骼肌生物鐘在其中的作用逐漸凸顯[39，40]。Bmal1-/-小鼠呈現(xiàn)出非快速動眼期（non-rapid eye movement，NREM）睡眠量增加，睡眠恢復(fù)能力降低[41]。通過分別在全身Bmal1-/-小鼠大腦和骨骼肌中特異性恢復(fù)Bmal1 基因，發(fā)現(xiàn)骨骼肌恢復(fù)小鼠NREM 睡眠量與野生型小鼠一致，且在強迫覺醒后睡眠恢復(fù)能力提高，表現(xiàn)為睡眠量及慢波活動（slow wave activity，SWA）增加[40]；大腦恢復(fù)小鼠雖能重建晝夜節(jié)律但睡眠量及睡眠恢復(fù)能力并未改變[42]。而骨骼肌特異性敲除Bmal1進一步證明可使小鼠NREM睡眠量增加[40]。

目前，關(guān)于骨骼肌時鐘基因與睡眠的研究主要圍繞Bmal1，而且發(fā)現(xiàn)Bmal1-/-小鼠睡眠障礙并非完全由晝夜節(jié)律破壞引起。除此之外，其他時鐘基因（如Cry1/2）雙敲除可影響睡眠及SWA 變化[43]，但是否經(jīng)骨骼肌途徑還有待研究?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元作為睡眠缺失恢復(fù)的重要腦區(qū)在骨骼肌Bmal1過表達小鼠中呈活躍狀態(tài)[40，44]，推測其可能是經(jīng)骨骼肌調(diào)控睡眠的關(guān)鍵部位。骨骼肌所分泌乳酸、組織蛋白酶B、鳶尾素等肌肉分泌因子可能在介導睡眠方面發(fā)揮潛在作用[45]。

4.2 骨骼肌時鐘基因與運動

運動是依賴于細胞、組織和器官相互協(xié)調(diào)的生理活動過程，其作為一種授時因子（zeitgeber）可影響骨骼肌節(jié)律變化，同時也受到骨骼肌固有時鐘的調(diào)控。

運動表現(xiàn)能力與時間密切相關(guān)，通過測試小鼠不同時間段的低中強度水平運動，發(fā)現(xiàn)小鼠夜間晚期運動持續(xù)時間以及維持血糖能力優(yōu)于夜間早期[46]；人體中也呈現(xiàn)出力量、耐力等運動表現(xiàn)在下午高于清晨[47]。有研究發(fā)現(xiàn)跨時區(qū)產(chǎn)生的時差變化也影響運動表現(xiàn)能力，與向西跨經(jīng)度旅行相比，向東跨經(jīng)度旅行可使人體在間歇性短跑運動中表現(xiàn)下降、疲勞感更強[48]。時鐘基因是運動表現(xiàn)差異原因之一，Cry1/2作為過氧化物酶體增殖物激活受體δ（peroxisome proliferator-ac?tivator receptor，PPARδ）共抑制因子可調(diào)控運動能力[49]；Per1/2雙敲除小鼠在不同時間段運動下并未顯示出運動持續(xù)時間和血糖水平的差異[46]，但其原因是節(jié)律紊亂，還是時鐘基因PER 轉(zhuǎn)錄蛋白作為關(guān)鍵因子功能缺失所致尚不明確。

運動可以調(diào)控骨骼肌分子時鐘。研究發(fā)現(xiàn)計劃性運動可影響骨骼肌自身節(jié)律表達，使時鐘基因相位前移2～3個小時，而不影響SCN節(jié)律變化[15]；去除嚙齒類動物骨骼肌運動神經(jīng)元會導致晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄活性失調(diào)[50]；與未經(jīng)訓練的個體相比，耐力訓練運動員原代肌肉細胞中Sirt1和Nampt呈節(jié)律性表達[51]。雖然以上研究提示運動可調(diào)控節(jié)律，但應(yīng)進一步探索調(diào)控途徑是針對骨骼肌生物鐘直接作用，還是運動引起全身激素、體溫等變化繼發(fā)影響骨骼肌節(jié)律。

此外，不同運動募集骨骼肌纖維類型也可能影響肌肉晝夜節(jié)律表達，高強度抗阻運動中Ⅱ型纖維募集高，低強度耐力運動主要募集Ⅰ型纖維，兩種類型骨骼肌晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)因此也不相同[52]。時鐘基因在調(diào)節(jié)骨骼肌纖維類型中發(fā)揮重要作用，肌肉特異性Bmal1基因敲除可致小鼠肌纖維類型向Ⅰ型轉(zhuǎn)變[36]；Rev-erbα作為Bmal1抑制因子，在Rev-erbα-/-小鼠比目魚肌中發(fā)現(xiàn)纖維類型從Ⅱ型向Ⅰ型轉(zhuǎn)變，但變化較小[11]。有研究提出抗阻運動可使老年人骨骼肌Ⅱ型纖維增多、Ⅰ型纖維降低[53]，然而仍待實驗進一步探索。

因此，運動可以調(diào)控骨骼肌時鐘基因，而時鐘基因又影響運動表現(xiàn)能力。針對特定時間訓練，可能在改善生物鐘和外源性明暗周期失調(diào)（如輪班工作、跨時區(qū)旅行、長時間光照暴露等）導致的節(jié)律紊亂中具有重要意義。

5 總結(jié)與展望

骨骼肌作為外周組織，不僅受到中樞時鐘SCN 調(diào)控，其自身也擁有組織特異性節(jié)律表達。時鐘基因在體內(nèi)調(diào)節(jié)復(fù)雜的生理過程，包括維持骨骼肌質(zhì)量及結(jié)構(gòu)，參與成肌分化和糖、脂代謝，影響睡眠和運動。通過全身性或組織特異性方式敲除時鐘基因動物模型，對晝夜節(jié)律與骨骼肌生理功能有了一定探索，但是也面臨諸多問題。目前，對于骨骼肌晝夜節(jié)律的探索大都以嚙齒類動物模型為主，經(jīng)對比核心時鐘基因表達相位，結(jié)果顯示其夜間活動、白天睡眠的節(jié)律方式與人類相差8～10小時。故通過嚙齒類動物研究人類晝夜節(jié)律有一定局限性，未來人體原代肌肉細胞體外培養(yǎng)將成為骨骼肌節(jié)律研究的有力工具。

全面闡述骨骼肌晝夜節(jié)律以及外部因素對其的影響，可為相關(guān)疾病干預(yù)提供指導，如在肌肉減少癥中會出現(xiàn)肌肉丟失、力量下降，明確維持肌肉穩(wěn)態(tài)的時間調(diào)節(jié)機制有助于治療肌肉萎縮；對于內(nèi)源性生物鐘和外源性明暗周期失同步產(chǎn)生睡眠障礙等問題，骨骼肌中Bmal1可能是治療的有效靶點。了解骨骼肌時鐘基因調(diào)節(jié)睡眠的機制有助于探索治療睡眠障礙疾病的新手段。同時也有助于為運動訓練中獲得更優(yōu)運動成績，以及運動員在不同時區(qū)競賽過程中更好地恢復(fù)運動能力提供新方法。

未來研究中，仍有許多問題有待進一步探索和證實，如維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)過程中Bmal1敲除是由于破壞生物鐘導致其他關(guān)鍵因子失效，還是由于Bmal1自身特定功能引起；Per與Cry在骨骼肌成肌分化中如何發(fā)揮作用；代謝途徑中時鐘基因如何介導其他組織器官共同參與完成功能；除骨骼肌Bmal1外，其他生物鐘基因是否也調(diào)控睡眠。此外，運動干預(yù)失眠、改善睡眠質(zhì)量的效應(yīng)機制一直為國內(nèi)外學者所關(guān)注，而骨骼肌作為運動的主效應(yīng)器官，上述時鐘基因表達與調(diào)控有無可能是其中的核心或媒介機制？這或許可為開展相關(guān)研究提供新的視角。