長期高強度間歇訓練加重自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化

黃紅梅 胡宗祥 劉昭強 薄海 彭朋

1 集美大學體育學院（福建廈門361021）

2 中國人民武裝警察部隊后勤學院衛(wèi)生勤務系（天津300309）

高血壓患者由于血壓升高（壓力超負荷）激活神經-內分泌系統(tǒng)，造成心肌細胞、非心肌細胞及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）基因表達發(fā)生改變，使心臟結構、代謝與功能經歷長期的模式改建過程，稱為心臟重塑（cardiac remodeling）[1]。心肌ECM 在心臟生長發(fā)育、結構重塑以及功能穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。心肌ECM主要成分是膠原（Ⅰ型為主，占80%以上），由成纖維細胞產生，膠原合成與降解動態(tài)平衡對于維持心臟正常結構與功能具有重要調節(jié)效應。高血壓患者由于長期血壓升高造成心肌膠原代謝紊亂甚至發(fā)生心肌纖維化、心肌細胞凋亡，最終引發(fā)心臟結構與功能異常甚至心力衰竭（心衰），說明ECM穩(wěn)態(tài)失衡是高血壓心臟重塑及病情進展的原因之一[2]?；|金屬蛋白酶（ma?trix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅依賴性蛋白水解酶家族，催化ECM 蛋白降解，其中MMP-2 是最重要的一種MMPs，在多數(shù)細胞呈現(xiàn)組成型表達，其作用是降解變性膠原及其他ECM蛋白。MMPs受組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的負反饋性調節(jié)，以防止ECM過度降解?？梢奙MPs/TIMPs 穩(wěn)態(tài)平衡對于維持膠原正常代謝至關重要[2]。此外，轉化生長因子-β1（transforming growth fac?tor-β1，TGF-β1）介導的信號通路是多種疾病導致心肌纖維化的共同途徑，可通過促進心肌成纖維細胞向成肌纖維細胞表型轉化以及上調結締組織生長因子（con?nective tissue growth factor，CTGF）等細胞因子表達，誘導纖維細胞增殖，進而促進心肌纖維化[3]。因此，MMPs/TIMPs 和TGF-β1分別是介導膠原降解與合成的主要調控因子。研究發(fā)現(xiàn)[2]，MMPs/TIMPs穩(wěn)態(tài)失衡（降解減少）以及TGF-β1持續(xù)激活（合成增加）是高血壓心肌纖維化的主要分子機制。

積極改變生活方式是高血壓管理的有效手段，其中規(guī)律體力活動是健康生活方式的重要方面。研究顯示[4]，中等強度持續(xù)訓練（moderate intensity continu?ous training，MICT）是高血壓患者臨床康復的主要方式，能夠顯著改善患者心肺適能，降低血壓水平，下調多種心血管危險因素，提高生活質量并降低住院率與死亡率。他人[5]以及本課題組[6-9]前期的動物實驗證實，MICT還可減輕高血壓大鼠心肌纖維化，促進心肌細胞再生，從而抑制病理性心臟重塑。因此，MICT 已成為多種慢性非傳染性疾?。òǖ幌抻谛乃?、高血壓、糖尿病、肥胖等）患者一級和二級預防的重要策略[4]。然而針對高血壓患者的最佳運動康復處方仍未確定。

流行病學研究發(fā)現(xiàn)[10]，心肺適能是心血管疾病患者全因死亡率的強預測因子，也是評估臨床與康復治療效果及預后的重要指征。提升心肺適能包括兩種訓練模式，即傳統(tǒng)MICT和近些年來新興的高強度間歇訓練（high intensity interval training，HIIT）。據(jù)報道，3次/周、共2 周的HIIT 即可改善健康無訓練經歷者[11]、2型糖尿病患者[12]和運動員[13]的運動能力，與MICT 產生類似的效應。然而，針對競技運動員[14]以及實驗動物[15，16]的研究顯示，長期大強度耐力訓練導致心肌損傷甚至發(fā)生纖維化，誘發(fā)心血管不良事件。由于HIIT 同樣屬于大強度運動，故推測長期HIIT 同樣可造成心肌適應不良。Holloway等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食誘導的高血壓大鼠進行4 周HIIT 后心臟重塑加重，心肌纖維化未得到改善；而有研究則證實，4周HIIT通過改善心肌線粒體穩(wěn)態(tài)，抑制心肌梗塞（心梗）后心衰大鼠的心臟重塑[18，19]，8 周HIIT 減輕自發(fā)性高血壓大鼠（spontane?ously hypertensive rats，SHR）心肌膠原過度沉積并延緩心衰進程[9]。因此，HIIT對心臟（尤其是病理狀態(tài)下）的作用尚存在爭議。鑒于此，本研究將運動干預時間由前期的8 周[9]延長至18 周（相當于人類運動10年），旨在對比MICT和HIIT對SHR心肌膠原代謝和心臟重塑的影響，并探討TGF-β1信號通路和MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)平衡在其間的作用機制，探討不同強度運動對病理狀態(tài)下心臟的長期效應以及劑量-反應關系，為制定針對高血壓患者的最佳運動康復處方提供循證依據(jù)和干預靶點，并為其它心血管系統(tǒng)疾病的研究、預防提供有益借鑒。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與分組

45只3月齡雄性SHR，體質量220±18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0027。同時以15 只同齡、同性別Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓組（WKY）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～22℃，濕度50%～60%，12∶12 h 明暗周期，分籠飼養(yǎng)（3只/籠），自由進食水。動物適應環(huán)境1周后利用隨機數(shù)字表法將SHR 分為安靜對照組（SHR-untrain?ing，SHR-UT 組，n＝15）、MICT 組（SHR-MT 組，n＝15）和HIIT組（SHR-HT組，n＝15），其中SHR-MT和SHRHT 組動物分別進行18 周MICT 或HIIT，SHR-UT 和WKY組則在鼠籠內安靜飼養(yǎng)。

1.2 運動方案

所有動物先進行5 d跑臺適應性訓練，方案為：速度10～15 m/min，坡度0°，時間：30 min/d。隨后參照本課題組前期建立的方法[9]測定大鼠運動能力：起始負荷5 m/min，坡度0°，每2 min 增加1.5 m/min，直至力竭，記錄最大跑速（maximal velocity，Vmax）。

根據(jù)Hoydal 等[20]建立的大鼠跑速與最大攝氧量關系以及本課題組前期研究[9]制定18 周跑臺訓練方案（見表1），訓練負荷（包括跑速、時間、組數(shù)以及頻率）隨時間逐漸遞增。分別于第4、8、12 和16 周重新測定Vmax 并及時調整訓練強度（跑速）。每次訓練時保證兩組總負荷（運動時間×運動強度×組數(shù)）基本一致。

1.3 動脈血壓以及超聲心電圖檢測

每周訓練前以及末次訓練后48 h，采用智能無創(chuàng)血壓測量儀（BP-2010E，日本）測定尾動脈收縮壓（sys?tolic blood pressure，SBP）。末次血壓測定后稱量體質量（body mass，BM）（g），用小動物超聲影像系統(tǒng)（Visu?alSonicsVevo 3100，加拿大）進行超聲心電圖檢測，參數(shù)包括：左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）、左心室舒張末期直徑（left ventricular end-di?astolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期直徑（left ventricular end- systolic diameter，LVESD）和左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.4 大鼠取材與指標檢測

超聲心電圖檢測后斷頭處死動物，取出心臟（分離左心室）、腎上腺和胸腺，分別稱其質量（mg）并計算心臟質量指數(shù)（heart mass index，HMI）（HMI＝心臟質量÷BM）、左心室質量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）（LVMI＝左心室質量÷BM）、腎上腺質量指數(shù)（adrenal mass index，AMI）（AMI＝腎上腺質量÷BM）和胸腺質量指數(shù)（thymic mass index，TMI）（AMI＝胸腺質量÷BM）。將左心室分為兩部分，一部分用于心肌病理組織學觀察，另一部分用錫紙包裹迅速轉移至－80℃低溫冰箱凍存待測基因表達。

表1 SHR-MT和SHR-HT組18周跑臺訓練方案

1.4.1 心肌病理組織學觀察

于心臟橫切面取厚度為2 mm 組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋并利用病理切片機（RM2255，德國）制作5 μm 切片。用Masson 染色膠原纖維，倒置相差顯微鏡（歐林巴斯IX71，日本）下選取10 個視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件（Im?age Pro Plus 6.0，美國）測量結締組織面積與所測視野面積的比值，作為膠原容積分數(shù)（collagen volumetric fraction，CVF）。用HE染色心肌細胞，鏡下觀察細胞形態(tài)并獲取細胞橫截面積（cross-sectional area，CSA），所用儀器和軟件同Masson染色。

1.4.2 心?、裥湍z原（type Ⅰcollagen，ColⅠ）含量檢測

取適量心肌組織于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中勻漿，4 ℃、3 000 g 離心20 min，按照試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明進行操作，利用紫外分光光度計（日立U-3010，日本）以比色法測定450 nm 波長處的OD 值，參照標準品計算心肌ColⅠ含量（單位為：pg/mg蛋白）。

1.4.3 胚胎基因mRNA表達檢測

取心肌組織提取總RNA 后逆轉錄獲取cDNA，隨后采用RT-PCR（ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，美國）測定胚胎基因mRNA 表達量，包括心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-myo?sin heavy chain，β-MHC）。引物序列分別如下：ANP：上游：5’-GGG GGT AGG ATT GAC AGG AT-3’，下游：5’-CTC CAG GAG GGT ATT CAC CA-3’；β-MHC：上游：5’-CCT CGC AAT ATC AAG GGA AA-3’，下游：5’-TAC AG GTG CAT CAG CTC CAG-3’；β-肌動蛋白（β-actin）（內參基因）：上游：5’-AGA CCT TCA ACA CCC CAG-3’，下游:5’-GGG CAC AGT GTG GGT GAC-3’。反應條件：95℃、5 min；94℃、20 s，60℃、20 s，72℃、10 s；共40 個循環(huán)。以各組與β-actin的比值計算目的基因相對表達量。

1.4.4 心肌蛋白表達量檢測

利用Western Blot 法檢測蛋白表達量，包括MMP-2（64 kDa 和72 kDa）（Santa cruz 公司，sc-13594，稀釋比1∶2000）、TIMP-2（Santa cruz公司，sc-21735，稀釋比1∶5000）、TGF-β1（Santa cruz公司，sc-65378，稀釋比1∶2000）、CTGF（Abcam公司，ab6992，稀釋比1∶5000）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（Abcam公司，ab32575，稀釋比1∶5000），內參蛋白為βactin（SANTA CRUZ公司，sc-81760，稀釋比1∶5000）或3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de?hydrogenase，GAPDH）（Abcam公司，ab181602，稀釋比1∶10000）。心肌組織勻漿后，提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取100 μg 蛋白樣品在垂直電泳儀上經7.5% SDS-PAGE 分離后轉移至PVDF 膜。兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司，AR1017，稀釋比1∶2000）37℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL 發(fā)光成像，利用凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS，美國）拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與β-actin 或GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。SBP 隨時間的變化采用重復測量方差分析，其他各參數(shù)組間比較使用單因素方差分析，若F檢驗具有統(tǒng)計學意義，則多重比較采用Newman-Keuls檢驗。顯著性水平定為α＝0.05。統(tǒng)計軟件使用SPSS 20.0 for Windows。

2 結果

2.1 樣本量分析

在實驗過程中，由于拒跑、意外死亡等原因，共剔除8只大鼠，因此最終樣本量n＝52，其中WKY組（n＝15）、SHR-C 組（n＝14）、SHR-MT 組（n＝11）和SHRHT組（n＝12）。

2.2 SBP的動態(tài)變化

SBP 的動態(tài)時程變化見圖1。WYK 組各時間點SBP 均低于其他3 組（P＜0.05）；SHR-MT 和SHR-HT 組SBP于第4周時開始下降（P＜0.05），隨后SHR-MT組下降趨勢一直持續(xù)至訓練結束后（P＜0.05），而SHR-HT組則呈現(xiàn)雙相變化特征，即第4～9 周下降（P＜0.05），第10 周開始升高并于第15 周與SHR-UT 組無顯著性差異（P＞0.05），其中第13～18 周高于SHR-MT 組（P＜0.05）。

圖1 SBP的動態(tài)變化

2.3 體重以及各組織質量的變化

體重以及各組織（心臟、腎上腺和胸腺）質量的變化見表2。與WKY組比較，SHR-UT組BM和TMI下降（P＜0.05），HMI、LVMI 和AMI 升高（P＜0.05）。與SHRUT 組比較，SHR-MT 組AMI 下降（P＜0.05），TMI 升高（P＜0.05）；SHR-HT 組HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。與SHR-MT 組比較，SHRHT 組HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。

表2 體重以及心臟、腎上腺和胸腺質量的變化

2.4 心臟結構與功能的變化

超聲心動圖結果見圖2，心臟結構與功能的變化見表3。與WKY 組比較，SHR-UT 組LVEDD、LVESD 和LVEF 下降（P＜0.05），LVWT 升高（P＜0.05）。與SHRUT 組 比 較，SHR-MT 組LVEDD、LVESD、LVWT 和LVEF 升高（P＜0.05）；SHR-HT 組LVEDD 和LVESD 升高（P＜0.05），LVWT 和LVEF 下降（P＜0.05）。與SHRMT 組比較，SHR-HT 組LVEDD 升高（P＜0.05），LVWT和LVEF降低（P＜0.05）。

圖2 超聲心動圖

表3 心臟結構與功能的變化

2.5 心肌病理組織學觀察

心肌Masson 染色結果見圖3，心臟CVF 的變化見圖4，ColⅠ含量的變化見圖5。Masson 染色結果顯示，心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。WKY組心肌肌束間有極少量膠原纖維；SHR-UT 和SHR-HT 組心肌間質可見明顯纖維化改變及膠原沉積，CVF和ColⅠ含量均較WKY 組顯著升高（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組纖維化程度明顯減輕，CVF 和ColⅠ含量下降（P＜0.05），SHR-HT組膠原沉積加重且CVF、ColⅠ含量進一步升高（P＜0.05）。

心肌HE 染色結果見圖6，心肌細胞CSA 的變化見圖7。HE染色結果顯示，心肌細胞胞漿染成粉紅色，細胞核呈藍色。WKY 組心肌細胞排列規(guī)整，SHR-UT 和SHR-HT 組細胞排列紊亂，體積增大，CSA 高于WKY組（P＜0.05）；SHR-MT 組心肌細胞排列較SHR-UT 和SHR-HT 組規(guī)整，但心肌細胞肥大并未減輕，CSA 仍高于WKY組（P＜0.05）。

圖3 心肌Masson染色（×400）

圖4 心臟CVF的變化

圖5 心臟ColⅠ含量的變化

圖6 心肌HE染色（×400）

圖7 心肌細胞CSA的變化

2.6 心肌胚胎基因表達的變化

心肌胚胎基因表達的變化見圖8。與WKY 組比較，SHR-UT和SHR-HT組ANP和β-MHC mRNA表達量上調（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組ANP和β-MHC mRNA 表達量下調（P＜0.05），SHR-HT 組表達量則上調（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組胚胎基因表達量上調（P＜0.05）。

圖8 心肌胚胎基因表達的變化

2.7 心肌MMP-2和TIMP-2蛋白表達量的變化

心肌MMP-2 蛋白表達量的變化見圖9。與WKY組比較，SHR-UT 和SHR-HT 組64 kDa MMP-2 蛋白表達量下調（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2蛋白表達量上調（P＜0.05），SHR-HT組則無顯著性變化（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHRHT 組64 kDa MMP-2 蛋白表達量下調（P＜0.05）。各組72 kDa MMP-2 蛋白表達量均無顯著性差異（P＞0.05）。

心肌TIMP-2蛋白表達量的變化見圖10。與WKY組比較，SHR-UT 和SHR-MT 組TIMP-2蛋白表達量下調（P＜0.05）；與SHR-UT組比較，SHR-MT組TIMP-2蛋白表達量無顯著性變化（P＞0.05），SHR-HT 組則上調（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組TIMP-2 蛋白表達量上調（P＜0.05）。

64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值的變化見圖11。與WKY 組比較，SHR-UT 和SHR-HT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05），SHR-MT組升高（P＜0.05）；與SHR-UT 組 比 較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加（P＜0.05），SHR-HT 組則降低（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05）。

圖9 心肌MMP-2蛋白表達量的變化

圖10 心肌TIMP-2蛋白表達量的變化

圖11 64 kDa MMP-2/TIMP-2比值的變化

2.8 心肌TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表達量的變化

心肌TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表達量的變化依次見圖12、圖13和圖14。與WKY組比較，SHR-UT、SHR-MT和SHR-HT組TGF-β1、CTGF以及SHR-UT和SHR-HT 組α-SMA 蛋白表達量上調（P＜0.05），SHRMT 組α-SMA 表達量無顯著性變化（P＞0.05）；與SHRUT 組比較，SHR-MT 組TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表達量下調（P＜0.05），SHR-HT組則無顯著性變化（P＞0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表達量升高（P＜0.05）。

圖12 心肌TGF-β1蛋白表達量的變化

圖13 心肌CTGF蛋白表達量的變化

圖14 心肌α-SMA蛋白表達量的變化

3 討論

3.1 主要發(fā)現(xiàn)

本研究旨在探討長期（18周，相當于人類10年）不同強度運動對SHR 心肌纖維化的影響及機制，結果發(fā)現(xiàn)：MICT 后心肌膠原含量和α-SMA表達降低，TGF-β1介導的信號途徑受到抑制，MMP-2/TIMP-2 平衡得到改善，心臟發(fā)生生理性肥大的同時，胚胎基因表達下調，心功能提高，說明MICT通過降低膠原合成、促進膠原降解并抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞分化，改善心肌纖維化，進而延緩SHR 心臟重塑和心衰進程。然而HIIT 后膠原含量進一步增加，MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)失衡，但TGF-β1信號通路和α-SMA表達并無顯著性變化，心臟病理性肥大加劇，胚胎基因表達上調，心功能下降，提示HIIT通過抑制膠原降解（但對膠原合成無顯著影響）加重心肌纖維化（反應性心肌纖維化），繼而加速SHR 心臟重塑和心衰進程。因此，長期運動訓練對高血壓患者的心臟健康效應具有訓練強度依賴性。

3.2 不同強度運動對SHR 心臟結構、功能以及心肌纖維化的影響

心臟肥大是高血壓時應對過高室壁應力的代償反應，在本研究中，與WKY 組比較，SHR-UT 組HMI、LV?MI 以及心肌細胞CSA 升高，超聲檢查發(fā)現(xiàn)LVEDD 和LVESD下降、LVWT增加，提示心臟表型發(fā)生向心性肥大（心肌肥大伴心腔縮窄）。伴隨心臟代償能力下降，心功能（LVEF）降低并逐步轉向心衰，ANP 和β-MHC mRNA 表達量上調亦證實了這一點（胚胎基因過表達是心衰進展與預后的重要標志物[21]）。因此，高血壓誘導的心臟肥大屬于病理性心臟肥大，其原因是心肌細胞體積增大和膠原沉積增加共同作用所致。經過18周MICT 后，SHR-MT 組HMI、LVMI 以及心肌細胞CSA與SHR-UT組并無顯著性差異，似乎說明MICT并未改善高血壓性心臟肥大。然而超聲檢測進一步顯示，LVEDD、LVESD和LVWT升高，提示心臟發(fā)生離心性肥大。由于心功能（LVEF）提高，因此，運動誘導SHR 心臟由病理性肥大向生理性肥大轉變，同時心衰進程得以延緩（胚胎基因表達下調）。這與本課題組前期研究[9]、Garciarena 等[22]讓SHR進行持續(xù)游泳耐力訓練、施曼莉等[23]讓心梗后心衰大鼠進行中等強度持續(xù)跑臺運動以及針對耐力項目運動員流行病學調查[24]的結果一致。出乎意料的是，SHR-HT 組雖然在表型上同樣發(fā)生離心性肥大（HMI、LVMI、LVEDD和LVESD增加），但心腔擴張同時室壁變?。↙VWT 下降），這一改變將導致室壁應力大幅增加，加之胚胎基因進一步上調，提示HIIT 加重病理性心臟肥大并加速心衰進程，這與本課題組前期[16]采用長期隨意轉輪運動的研究結果類似。此外，由于SHR-HT 組CSA 并無顯著性變化而CVF 和Col-I含量升高，因此HIIT誘導的心臟肥大主要與膠原過度沉積有關。

心肌纖維化是高血壓患者最常見的并發(fā)癥，導致心臟硬度增加以及心室壁順應性下降，進而影響心臟舒縮功能[25]，增加心肌電不均一性（heterogeneity），易引發(fā)室性心律失常，是心血管疾病患者心源性猝死的重要原因[2]。在本研究中，SHR-UT 組較WKY 組心肌ColⅠ含量增加，Masson染色結果顯示心肌CVF升高，提示伴隨高血壓進展，心臟膠原過度沉積并最終引起心肌纖維化。調控ECM 穩(wěn)態(tài)是抑制心臟病理性重塑、防治諸多心血管疾病的重要策略。經過18周運動后，SHRMT 組CVF 和ColⅠ含量較SHR-UT 組明顯下降，但仍高于WKY 組，提示長期MICT 能夠延緩SHR 心肌纖維化，與課題組前期研究結果一致[6，8，9]。膠原減少有利于恢復心動周期過程中異常的心肌收縮力分布以及提高心室壁順應性[26]，進而增強心臟舒縮功能。此外，Choi等[27]的研究還發(fā)現(xiàn)，有氧運動可通過減少心肌膠原交聯(lián)，改善增齡引起的心臟舒張障礙。因此，我們推測，MICT對膠原網(wǎng)絡的生化組成和空間結構均具有積極作用。HIIT 對心肌纖維化的影響鮮有關注，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，8 周HIIT 減輕SHR 心肌纖維化；而Holloway 等[17]則證實，4周HIIT未改善高鹽飲食誘導的高血壓大鼠心肌膠原沉積，可能與動物模型不同以及干預時間較短有關。然而令人意外的是，本研究將干預時間延長至18周后，SHR-HT組CVF和ColⅠ含量較SHR-UT 組進一步增加，說明長期HIIT 加重左室纖維化。研究顯示，長期高強度劇烈運動同樣可導致運動員[14]或健康大鼠[15]發(fā)生心肌纖維化，但主要存在于心房和右心室，提示健康與疾病狀態(tài)下過度運動誘導的心肌纖維化可能存在部位特異性。由于本研究僅對左心室進行取材，因此HIIT 對其他心臟部位膠原沉積的影響尚未明確。

心肌纖維化表型按照有無細胞壞死和瘢痕形成分為反應性、浸潤性和替代性三種類型[28]。浸潤性和替代性心肌纖維化存在炎癥細胞浸潤、細胞壞死甚至瘢痕形成，同時伴隨成纖維細胞（fibroblast）向成肌纖維細胞（myofibroblast）轉化，后者膠原蛋白合成和分泌能力明顯增加，且具有較強的遷移和促纖維化作用[28]。α-SMA 是成肌纖維細胞標志物，其表達量是診斷心肌纖維化類型的重要參考標準[29]。在本研究中，SHR-UT組α-SMA表達量顯著上調，提示SHR發(fā)生浸潤性或替代性心肌纖維化；18 周運動后，SHR-MT 組α-SMA 蛋白表達量下調，說明MICT在改善心肌纖維化的同時還能夠抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞分化。值得注意的是，SHR-HT 組雖然CVF 和ColⅠ含量較SHR-UT 組升高，但α-SMA蛋白表達量并未進一步上調，提示高強度運動誘導的心肌纖維化類型屬反應性心肌纖維化。Aschar等[30]同樣發(fā)現(xiàn)，健康小鼠6周高強度運動后成纖維細胞數(shù)量明顯升高，而成肌纖維細胞并未增加。Benito等[15]證實，長期劇烈運動誘導的大鼠心肌纖維化在停訓8 周后即得到完全逆轉，說明運動性心肌纖維化具有可逆性特征。由此推斷，SHR-HT 組大鼠若及時停訓或將運動強度降低，其心肌纖維化程度將得以緩解。由于反應性心肌纖維化僅ECM 異常增多，無細胞壞死或瘢痕形成，且可通過一定干預手段改善和逆轉[28]，因此，在訓練期間監(jiān)測α-SMA的變化對于評價干預效果并及時調整干預策略具有指導意義。

3.3 不同強度運動對SHR心肌纖維化信號通路的影響

高血壓時發(fā)生心肌纖維化的具體機制尚未完全明確，可能與MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)平衡（司膠原降解）以及TGF-β1信號途徑（司膠原合成）異常有關[2]。MMP-2合成初始是以無活性的酶原（酶前體）形式存在（72 kDa MMP-2），隨后通過翻譯后調控而活化（64 kDa MMP-2）[31]；TIMP-2 可與MMP-2 形成穩(wěn)定復合物，阻礙酶原活化或抑制已活化的酶活性。在本研究中，與WKY 組比較，SHR-UT 組72 kDa MMP-2 蛋白表達量并無顯著性差異，而64 kDa MMP-2降低，說明高血壓對MMP-2酶原并無影響，但顯著抑制MMP-2活性，這與黃偉等[32]以衰老大鼠為模型的研究結果類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，SHR-UT 組TIMP-2 蛋白表達量較WKY 組下降，似乎暗示TIMP-2 對MMP-2 的抑制效應減弱。Yang等[33]的研究結果進一步顯示，MMPs與TIMPs之間的動態(tài)平衡（用兩者的比值表示）是膠原代謝的決定因素。本研究中SHR-UT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值較WKY組下降，說明MMP-2活性受到TIMP-2的抑制，其降解膠原的作用降低。此外，SHR-UT組TGF-β1和CTCF 蛋白表達量升高，因此，SHR 心肌纖維化是TGF-β1過表達誘導膠原合成增加以及MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)失衡造成膠原降解減少共同作用所致。

經過18 周MICT，與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2明顯升高，而TIMP-2表達量無顯著性變化，故64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加，提示TIMP-2 對MMP-2 的抑制作用得到解除，MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)失衡改善，膠原降解增加，這與Kwak 等[34]的研究結果一致，即12 周跑臺運動上調衰老大鼠MMP-2 活性。在甄潔等[35]的研究中，心梗后心衰大鼠進行10周跑臺訓練后雖然MMP-1和TIMP-1蛋白表達量均顯著下降，但MMP-1/TIMP-1比值增加，與本研究結果類似。與此同時，SHR-MT 組TGF-β1和CTGF 表達量較SHR-UT組下調，提示MICT通過增加膠原降解并抑制其合成而改善SHR心肌纖維化。在Rossoni等[5]的研究中，老年SHR進行13周低強度（50%Vmax）跑臺運動后心臟CVF 下降、MMP-2 活性增加，而TGF-β1和CTGF表達量并無顯著性變化，由此認為運動對膠原合成并無影響，心肌纖維化減輕主要是膠原降解增加所致。動物年齡（老年vs.青年）、干預時間（13周vs.18周）以及運動強度（低強度vs.中等強度）等可能是不同研究結果存在差異的主要原因。然而18 周HIIT 后，與SHR-UT 組比較，SHR-HT 組64 kD MMP-2 無顯著性變化而TIMP-2 顯著升高，64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值下降，說明TIMP-2 對MMP-2 的抑制作用增強，MMP-2/TIMP-2 系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡進一步破壞，膠原降解減少。然而TGF-β1和CTGF表達量與SHR-UT組并無顯著性差異，提示長期HIIT 通過抑制膠原降解而加重心肌纖維化，但對膠原合成無明顯影響。該結果與Benito 等[15]的研究不同，他們發(fā)現(xiàn)，長期大強度持續(xù)跑臺運動誘導健康大鼠發(fā)生心肌纖維化，同時伴TGF-β1表達上調，可能與動物模型、運動方式和運動強度等因素有關。

3.4 對HIIT心臟效應的可能解釋

值得注意的是，本課題組前期研究結果顯示，4 周HIIT抑制心梗后心衰大鼠心臟重塑[18，19]，8周HIIT減輕SHR 心肌膠原沉積[9]，但我們將干預時間延長至18 周后卻發(fā)現(xiàn)心肌纖維化程度與心臟重塑加劇。Holloway等的研究[17]證實，4周HIIT加速高鹽飲食誘導的高血壓大鼠心衰進程。王增喜等[36]的研究顯示，6周HIIT可誘導健康大鼠暫時性病理性心臟肥大及心功能下降，10周時恢復。研究結果存在差異甚至矛盾可能與實驗對象、造模方式、運動負荷以及干預時間等因素有關。結合本研究結果，我們認為，HIIT對心臟的作用可能存在一過性特征。本研究稱取腎上腺和胸腺質量作為慢性應激參數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，SHR-HT 組較SHR-UT 組進一步發(fā)生腎上腺肥大和胸腺萎縮，因此HIIT 的心臟效應可采用應激學說來闡釋[37]。本研究設計的訓練負荷隨時間推移逐漸遞增，前8 周負荷較低（70%～80%Vmax、10～56 min/d、3～5 d/w），這種適宜的應激刺激引起氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡以及物質與能量代謝等基本信號轉導通路輕度激活，產生的各種細胞因子亦處于生理水平，進而誘導心臟產生良性適應。然而隨著運動負荷增加（后10 周：90%Vmax、56 min/d、5 d/w），運動應激超過了機體的代償能力，加之心臟重塑依然在隱匿中進行，上述信號途徑持續(xù)激活并產生過量（病理水平）有害因子（如氧自由基、促炎癥因子、促凋亡因子等），因此心臟逐漸發(fā)生適應不良。訓練期間SHR-HT組SBP的動態(tài)變化呈現(xiàn)雙相反應特征（先下降后升高）也間接印證了上述推斷。此外，高強度運動還可經由心理應激造成腸道菌群紊亂[38]，而后者是高血壓發(fā)生發(fā)展的原因之一[39]，故推測HIIT 尚能夠通過誘導腸道菌群失衡加重SHR心臟重塑。

4 結論

長期運動訓練對高血壓的心臟健康效應具有訓練強度依賴性，其機制與TGF-β1介導的信號途徑、MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)平衡對不同強度訓練的適應存在差異有關，其中MICT通過降低膠原合成并促進其降解以及抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞分化改善心肌纖維化，進而延緩SHR心臟重塑和心衰進程，而長期HIIT則通過抑制膠原降解（但對膠原合成無顯著影響）加重心肌纖維化（反應性心肌纖維化），繼而加速SHR 心臟重塑和心衰進程。因此，目前MICT仍然是高血壓患者運動康復的最佳方式，HIIT并非適用于任何人群（心血管疾病患者更應持謹慎態(tài)度），其安全性和有效性尚待進一步證實。