子癇前期孕婦體內(nèi)S100A12水平檢測(cè)及其血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和RAGE表達(dá)的影響

趙先蘭，潘淑敏，劉 彩

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

子癇前期孕婦體內(nèi)S100A12水平檢測(cè)及其血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和RAGE表達(dá)的影響

趙先蘭△，潘淑敏，劉 彩

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1965年10月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)，E-mail：zxl12129@163.com

子癇前期；S100A12；RAGE；滋養(yǎng)細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目的：檢測(cè)子癇前期孕婦外周血和胎盤(pán)組織中S100A12蛋白的表達(dá)，觀察其血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響，探討S100A12與子癇前期的關(guān)系。方法：選擇輕度子癇前期孕婦30例，重度子癇前期孕婦30例，同期入院分娩的正常孕婦30例(正常對(duì)照組)，采用ELISA法檢測(cè)孕婦外周血中S100A12水平，免疫組化法檢測(cè)胎盤(pán)組織中S100A12蛋白的表達(dá)水平。用各組孕婦血清體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h，另設(shè)無(wú)血清培養(yǎng)的空白對(duì)照組，應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況，Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體RAGE蛋白的表達(dá)。結(jié)果：輕、重度子癇前期組孕婦外周血及胎盤(pán)組織中S100A12水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且重度子癇前期組高于輕度子癇前期組(P<0.05)。輕、重度子癇前期組滋養(yǎng)細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率及RAGE蛋白的表達(dá)均明顯高于正常孕婦及空白對(duì)照組(P<0.05)，增殖率則降低(P<0.05)；重度子癇前期組較輕度子癇前期組變化更顯著(P<0.05)。結(jié)論：S100A12高表達(dá)可能是子癇前期的重要發(fā)病機(jī)制之一。

子癇前期是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒患病率及死亡率升高的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制迄今不明。研究[1]表明其病理根源在于胎盤(pán)。近年來(lái)子癇前期發(fā)病的炎癥機(jī)制再次受到重視。S100A12是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種促炎因子，在炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，參與機(jī)體的免疫防御或炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、生長(zhǎng)抑制、凋亡等，在炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病等許多疾病中發(fā)揮著重要作用[2]。目前尚不清楚S100A12與子癇前期之間的關(guān)系。該研究通過(guò)檢測(cè)S100A12在子癇前期孕婦血清及胎盤(pán)中的表達(dá)，分析子癇前期孕婦血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)表達(dá)的影響，探討其與子癇前期發(fā)病的關(guān)系，為進(jìn)一步尋找子癇前期的預(yù)測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2013年3月至12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科分娩的子癇前期患者60例,參照文獻(xiàn)[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類(lèi)，其中輕度30例，年齡23～30(27.3±4.0)歲，孕1～3(1.6±0.7)次；重度30例，年齡25～32(29.1±2.7)歲，孕1～3(1.8±0.9)次。選擇同期正常孕婦30例為正常對(duì)照組，年齡23～30(26.2±2.2)歲，孕1～3(1.7±0.6)次。所選研究對(duì)象均無(wú)其他妊娠期合并癥及并發(fā)癥。3組產(chǎn)婦年齡、孕產(chǎn)次等一般情況匹配。

1.2 標(biāo)本的采集、處理及保存 采取孕婦空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中，3 000 r/min 離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。胎盤(pán)娩出后，在胎盤(pán)母體面中央避開(kāi)出血、梗死及鈣化區(qū)取胎盤(pán)組織約1 cm×1 cm×1 cm，冷生理鹽水沖洗干凈后,甲醛固定。

1.3 外周血中S100A12水平的測(cè)定 以離心后血清為標(biāo)本，采用ELISA法按試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)說(shuō)明操作，在450 nm處測(cè)得吸光度(A)值，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出外周血中S100A12水平。

1.4 胎盤(pán)組織中S100A12蛋白的檢測(cè) 固定后的胎盤(pán)組織常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4 μm，脫蠟至水；用體積分?jǐn)?shù)3%H2O2清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；采用免疫組化SP法檢測(cè)胎盤(pán)組織中S100A12蛋白。S100A12抗人一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam生物技術(shù)公司，嚴(yán)格按免疫組化法操作步驟進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。參照Fromowitz等[4]陽(yáng)性細(xì)胞半定量分級(jí)法，觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以?xún)身?xiàng)得分相加的總分進(jìn)行判定：<2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 各組孕婦外周血中S100A12水平和胎盤(pán)組織中S100A12蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)圖1、表1。各組孕婦胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞等組織細(xì)胞中均可檢測(cè)到S100A12蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。輕度子癇前期組及重度子癇前期組孕婦外周血中S100A12水平和胎盤(pán)組織中S100A12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常對(duì)照組，重度子癇前期組高于輕度子癇前期組。

圖1 各組胎盤(pán)組織中S100A12蛋白的表達(dá)(SP，×200)

表1 3組孕婦外周血中S100A12水平及胎盤(pán)組織中S100A12陽(yáng)性表達(dá)率比較

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.001；#:與輕度子癇前期組比較，P<0.001。

2.2 子癇前期孕婦血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和RAGE表達(dá)的影響

2.2.1 各組滋養(yǎng)細(xì)胞增殖情況的比較 用輕、重度子癇前期組孕婦血清孵育滋養(yǎng)細(xì)胞 48 h后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形或多邊形變?yōu)闄E圓或圓形，細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞排列變疏松；正常孕婦組和空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本正常、無(wú)變化。輕、重度子癇前期組細(xì)胞增殖率明顯低于正常孕婦組和空白對(duì)照組；重度子癇前期組低于輕度子癇前期組。見(jiàn)表2。

2.2.2 各組滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率的比較 輕、重度子癇前期組滋養(yǎng)細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率均明顯高于正常對(duì)照組及空白對(duì)照組。見(jiàn)表2。

2.2.3 各組細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)的比較 輕、重度子癇前期組滋養(yǎng)細(xì)胞中RAGE蛋白的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組及空白對(duì)照組，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組滋養(yǎng)細(xì)胞中RAGE的表達(dá)

1：空白對(duì)照組；2：正常對(duì)照組；3：輕度子癇前期組；4：重度子癇前期組。

表2 4組滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和RAGE表達(dá)的比較

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與正常組比較，P<0.05；△：與輕度組比較，P<0.05。

3 討論

S100A12是一種存在于中性粒細(xì)胞中的胞質(zhì)蛋白, 是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小的酸性蛋白，屬于細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族中的一員[5]，具有S100蛋白家族的一些共性，有獨(dú)有的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，是一種具有促進(jìn)炎性反應(yīng)的鈣結(jié)合蛋白，其主要作用是使血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)，激活炎性細(xì)胞、化學(xué)趨化和抗微生物作用[2]。Saito等[6]研究表明慢性冠狀動(dòng)脈疾病患者血清S100A12水平與C反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)。RAGE是一種多配體的膜受體，與配體結(jié)合后可啟動(dòng)多條信號(hào)通路，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂[7-8]。S100A12與其受體RAGE結(jié)合后可激活包括磷脂酶C、蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ、分裂原激活蛋白激酶的激酶等[9]途徑，最終促使NF-κB入核，調(diào)節(jié)重要的目的基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)炎癥發(fā)生。同時(shí)NF-κB也是RAGE基因的核轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)RAGE基因的表達(dá)。因此，S100A12-RAGE結(jié)合后可通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)使信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，使“炎癥-抗炎”系統(tǒng)失衡，形成機(jī)體內(nèi)過(guò)度炎癥反應(yīng)。

近來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，子癇前期是母體對(duì)妊娠的一種過(guò)度性炎癥反應(yīng)。有學(xué)者[10-11]用內(nèi)毒素刺激成功建立了子癇前期動(dòng)物模型，且抗炎治療有效。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用抗炎藥物干預(yù)子癇前期的研究[12]均表明早期應(yīng)用小劑量阿司匹林可降低高危婦女子癇前期的發(fā)生率。也有學(xué)者[1]認(rèn)為子癇前期病理根源在于胎盤(pán)。滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致血管重塑，胎盤(pán)淺著床進(jìn)而導(dǎo)致胎盤(pán)缺血缺氧，胎盤(pán)發(fā)生缺血再灌注損傷，引起炎癥反應(yīng)，炎癥因子釋放后再作用于胎盤(pán)，形成“炎癥-胎盤(pán)缺血損傷”正反饋，形成子癇前期的病理特征。

該研究結(jié)果顯示：S100A12在正常及子癇前期孕婦外周血及胎盤(pán)組織中均有表達(dá)，但在輕、重度子癇前期組高表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦血清可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，而RAGE蛋白表達(dá)在子癇前期孕婦血清干預(yù)的滋養(yǎng)細(xì)胞中也呈相應(yīng)的高表達(dá)。提示S100A12可能參與了子癇前期的發(fā)病過(guò)程，子癇前期孕婦胎盤(pán)組織局部分泌并釋放S100A12是其重要來(lái)源。S100A12正常表達(dá)于中性粒細(xì)胞，同時(shí)在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞中有低表達(dá)。正常妊娠時(shí)，孕婦自身分泌少量S100A12蛋白，促進(jìn)多種炎性介質(zhì)的釋放，從而引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，并在一定水平上維持“炎癥-抗炎”系統(tǒng)的平衡。當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，過(guò)多的炎癥因子可引起免疫細(xì)胞分泌包括S100A12在內(nèi)的促炎因子，形成一個(gè)正反饋環(huán)路，S100A12的作用被放大，加重了靶器官的損傷，形成了子癇前期狀態(tài)下的病理改變。

綜上所述，S100A12在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用，然而其通過(guò)何種機(jī)制作用于子癇前期還需進(jìn)一步研究。

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(2014-09-13 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of S100A12 in preeclampsia and effects of serum from preeclampsia patients on proliferation, apoptosis and RAGE expression of trophoblast cells

ZHAOXianlan,PANShumin，LIUCai

DepartmentofObstetricsandGynecology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

preeclampsia;S100A12;RAGE;trophoblast cell;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To detect the expression of S100A12 in materal periphera blood, placenta of patients with preeclampsia, and investigate the effects of serum from the patients with preeclampsia on proliferation and apoptosis of trophoblast cells. Methods: A total of 60 women with preeclampsia(including 30 cases of mild preeclampsia and 30 cases of severe preeclampsia) and 30 healthy pregnant women(normal control group) were collected. The level of S100A12 protein in maternal peripheral blood was detected by ELISA. Immunohistochemistry method was used to measure the protein expression level of S100A12 in placenta. The trophoblast cells were cultured in vitro for 48 h with the serum from the three groups,and a blank control group was set up as well．The proliferation and apoptosis of trophoblast cell were measured by MTT assay and flow cytometry,and RAGE protein expression was measured by Western blot. Results: The level of S100A12 in maternal peripheral blood and placenta from patients with mild and severe preeclampsia was significantly higher than that of the normal control group(P<0.05). The proliferation rates of trophoblast cells in the mild and severe preeclampsia groups were significantly lower than those in normal control group and the blank control group(P<0.05).The early phase apoptosis rate，late phase apoptosis rate and total apoptosis rate and the level of RAGE protein of trophoblast cells in the mild and severe preeclampsia groups were significantly higher than those in the normal control group and the blank control group(P<0.05)． The changes of severe preeclampsia group were more significant than that of the mild group(P<0.05).Conclusion: The high expression of S100A12 protein may play an important role in pathogenesis of preeclampsia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.015

R714.51