傷科黃水經口給藥的長期毒性研究*

蔣春飛，劉東文，鄭芳昊

廣東省佛山市中醫(yī)院(佛山 528000)

傷科黃水由黃連、黃柏等共六味中藥組成，是佛山市中醫(yī)院自發(fā)研制的院內制劑，主要用于治療跌打損傷、軟組織及骨骼損傷等[1-5]。根據臨床觀察，傷科黃水的藥物療效確切，安全性較高，具備新藥開發(fā)的價值。目前，按照中藥新藥申報的要求已經完成了臨床前制劑工藝、質量標準和藥效學的研究工作，但是有關該制劑的毒副作用卻并不明確[6-13]?？紤]到傷科黃水為外用制劑，如果采用外敷的方式進行試驗，不容易充分暴露潛在的毒性。因此，本研究采用口服給藥的方式考察了傷科黃水重復給藥的毒副作用。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 試驗藥物：傷科黃水制劑(批號：17002，佛山市中醫(yī)院自制)，500 ml/瓶，醫(yī)療機構制劑注冊標準：粵ZB20111358。制備方法：按傷科黃水復方比例稱取黃連、黃柏、梔子藥材，加水煎煮1.5 h，過濾，收集濾液；藥渣加入白礬、紫草藥材，再煎煮45 min，加薄荷煮沸15 min，過濾，收集濾液；合并兩次濾液，濃縮至規(guī)定濃度，加入防腐劑，即得。給藥劑量參考小鼠急性毒性試驗的結果設計。經計算傷科黃水的LD50為51.66 g/kg，28.33 g/kg及以下劑量均未見動物死亡。結合LD50設置1/2的LD50，即25.83 g/kg為本次試驗的最高劑量，按體表面積折算為大鼠的等效劑量為18.33 g/kg，低、中劑量分別設置為高劑量的1/4、1/2。據此，試驗用藥配制方法為：將傷科黃水原藥液濃縮10倍，分別配置成含原藥材0.46 g/ml、0.92 g/ml、1.83 g/ml的藥液，供動物試驗用。

1.2 動物：SPF級SD大鼠32只，體質量180～300 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.3 試劑：0.9%氯化鈉注射液(批號：B17061502，湖南科倫制藥有限公司)；烏來糖(批號：20170105654，上海撫生實業(yè)有限公司)；尿質控液(批號：55170031，桂林優(yōu)利特集團有限公司)；尿液試紙條(批號：56170949，桂林優(yōu)利特集團有限公司)。

1.4 儀器：凈化工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司)；尿液分析儀(Uritest-200B，桂林優(yōu)利特集團有限公司)。

2 實驗方法 將SD大鼠按體重和性別隨機均衡分為4組，分別為空白對照組，傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組，每組8只，雌雄各半。試驗各組均以10 ml/kg灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。試驗期間，每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等，在給藥第1、4、7、11、14天測定大鼠體重。在剖檢前一天(給藥第14天)進行尿液、眼科檢查。剖檢當天處死全部大鼠，進行臟器檢查。

2.1 一般狀況觀察：給藥每天觀察動物外觀體征、行為活動、分泌物、呼吸、排泄物、中毒反應和死亡情況等。每天至少觀察1次，及時做好記錄，發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物，及時解剖檢查并盡量采血檢查。每周測定兩次體重。

2.2 眼科檢查：采用左右眼相互對比方法，進行動物雙眼的外觀檢查。用棉簽輕觸眼旁皮膚觀察雙瞼閉合、眼球轉動等活動情況；用光束照射眼睛觀察瞳孔對光反應是否正常；觀察角膜的透明度是否清晰；觀察結膜的顏色、血管、分泌物有否異常；觀察虹膜的形狀與平整度是否正常。

2.3 尿液檢查：通過擠壓法采集大鼠尿液，應不少于0.5 ml。進行尿液外觀檢查后，用尿液分析儀進行檢測。樣本應該及時檢測，如未能在樣本采集后馬上檢測，應將樣本放在2℃～8℃環(huán)境，并在8 h內進行檢測。檢測時環(huán)境溫度應控制在15℃～30℃。

2.4 臟器檢查：剖檢當天用20%烏來糖以0.75 ml/100g進行皮下注射麻醉，在大鼠麻醉狀態(tài)達外科麻醉期后，采用腹主動脈采血處死。系統(tǒng)剖檢后，肉眼觀察各器官和組織的變化，測定臟器重量，并采用10%中性福爾馬林固定。臟體系數(shù)、臟腦系數(shù)按如下公式計算：

結 果

1 一般狀況觀察 給藥第6、7天，傷科黃水18.33 g/kg劑量組雄性動物分別有3例、2例動物于給藥前排軟便；給藥第11天，雄性動物有1例動物出現(xiàn)稀便，1例動物出現(xiàn)水樣便，其余各組無明顯變化。與空白對照組相比，傷科黃水18.33 g/kg劑量組給藥第14天雌性動物的體重(P<0.05)和14 d內的增重(P<0.01)均明顯下降，其余各組無明顯變化。具體實驗結果參見表1。

2 眼科檢查 各組動物眼科檢查均未見異常。

3 尿液檢查

3.1 雌性動物：傷科黃水9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有2例、4例動物尿液外觀呈暗綠色。空白對照組有2例動物尿液隱血(+)，4例動物出現(xiàn)蛋白質(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有3例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有2例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)，1例動物蛋白質()，1例動物出現(xiàn)膽紅素(+)，1例動物出現(xiàn)尿膽原(+)，1例動物尿膽原(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有4例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)，3例動物出現(xiàn)膽紅素(+)，4例動物出現(xiàn)尿膽原(+)，1例動物出現(xiàn)白細胞(+)。

3.2 雄性動物：傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有1例、1例、4例動物尿液外觀呈暗綠色。給藥各劑量組尿比重高于空白對照組(P<0.05或P<0.01)，尿液pH低于陰性對照組(P<0.01)。空白對照組有1例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)，3例動物蛋白質(+)，4例動物出現(xiàn)酮體(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有1例動物尿液出現(xiàn)隱血(+)，1例動物隱血()，1例動物隱血()，1例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)，2例動物蛋白質(+)，1例動物蛋白質()。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有1例動物尿液出現(xiàn)蛋白質(+)，3例動物蛋白質()，1例動物出現(xiàn)酮體(+)，1例動物酮體(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有1例動物尿液出現(xiàn)隱血(+)，2例動物蛋白質(+)，2例動物蛋白質()，1例動物出現(xiàn)尿膽原(+)。

表1 傷科黃水連續(xù)給藥對SD大鼠體重的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表2 傷科黃水連續(xù)給藥對SD大鼠尿常規(guī)的影響(n=4)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

4 臟器檢查

4.1 雌性動物：受試各組動物未見明顯臟器損傷。傷科黃水18.33 g/kg劑量組胸腺臟器重量、臟體系數(shù)、臟腦系數(shù)低于空白對照組(P<0.05或P<0.01)，心臟臟器重量低于空白對照組(P<0.05)，其余各組無明顯差異。

4.2 雄性動物：受試各組動物未見明顯臟器損傷。傷科黃水9.16 g/kg劑量組睪丸臟腦系數(shù)低于空白對照組，其余各組未見統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表3 傷科黃水連續(xù)給藥對SD大鼠臟器重量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表4 傷科黃水連續(xù)給藥14 d對SD大鼠臟體系數(shù)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表5 傷科黃水連續(xù)給藥14 d對SD大鼠臟腦系數(shù)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

討 論

傷科黃水作為院內制劑在佛山市中醫(yī)院已有60多年的使用歷史，臨床療效確切，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。該制劑于2015年獲得廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥強省專項資金-醫(yī)院中藥制劑開發(fā)項目的資助，計劃通過3年的組織實施，深度改良制劑處方和制備工藝，提高質量標準，明確藥理藥效，使之成為安全性高、臨床療效確切、質量穩(wěn)定可控、使用方便的中藥制劑，并爭取培育成擁有自主知識產權的中藥新藥。本研究正是在處方固定、生產工藝穩(wěn)定、質量可控的前提下，根據國家食品藥品監(jiān)督管理局對中藥新藥注冊申報的要求，進行了長期毒性的初步研究。

有研究表明，黃連單味水煎液灌胃給小鼠后，會出現(xiàn)活動減少、呼吸急促、被毛粗亂的現(xiàn)象，部分小鼠甚至出現(xiàn)痙攣、死亡的情況，剖檢結果表明主要毒性靶器官為腦、肝、脾、肺、腎[4]。黃連、黃柏作為苦寒類中藥的代表，容易引起引起稀便甚至腹瀉[14-15]。本研究表明，傷科黃水經口給藥后，部分大鼠雖出現(xiàn)了軟便或稀便現(xiàn)象，與黃連、黃柏誘導的胃腸道刺激反應一致，但是對主要功能器官并未產生毒性作用。而傷科黃水作為外用制劑，通常透皮吸收后進入胃腸道的可能較小，不會引起胃腸道反應。另外，不同劑量的傷科黃水對大鼠尿液產生了一定影響，但經研究發(fā)現(xiàn)主要與藥物濃度有關，并未產生病理性代謝產物。因此，可以認為傷科黃水未有明顯的毒副作用。

本研究觀察了連續(xù)灌胃給予傷科黃水后大鼠產生的毒性反應及其嚴重程度，主要的毒性靶器官或靶組織及其損害的可逆性，為臨床主要監(jiān)測指標提供一定參考。