富血小板纖維蛋白對(duì)兔耳軟骨移植成活情況的影響

高堂俊 趙宇 吳亮亮 賈大平 柳芳

[摘要]目的：研究自體富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）對(duì)兔耳軟骨移植后成活的影響，為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。方法：選取16只新西蘭大白兔，于兔雙耳對(duì)稱處設(shè)計(jì)并剝離出大小、形狀相似，重量為80mg的耳軟骨塊，雙側(cè)耳軟骨塊隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組耳軟骨塊直接置入兔背部左側(cè)淺筋膜腔隙內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組耳軟骨塊聯(lián)合PRF共同置入兔背部右側(cè)淺筋膜腔隙內(nèi)。分別于2周、4周、8周、12周取材進(jìn)行大體觀察、重量比較及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、染色觀察（HE染色、番紅〇染色、阿利新藍(lán)染色）。結(jié)果：通過(guò)大體觀察和軟骨重量可見(jiàn)：2～4周耳軟骨塊重量增加，8～12周耳軟骨塊重量減小，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組耳軟骨塊重量均大于對(duì)照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。染色觀察可見(jiàn)：各時(shí)間點(diǎn)在相同顯微倍數(shù)、同一視野下實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，其中新生軟骨細(xì)胞也多于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組異染性軟骨基質(zhì)、藍(lán)色的糖胺聚糖均更明顯。結(jié)論：自體富血小板纖維蛋白能夠促進(jìn)兔耳軟骨移植后的存活。

[關(guān)鍵詞]富血小板纖維蛋白;鼻整形術(shù);耳軟骨移植;軟骨吸收;軟骨成活;細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）12-0097-05

Effect of Platelet-rich Fibrin on the Survival of Rabbit Ear Cartilage Transplantation

GAO Tang-jun，ZHAO Yu，WU Liang-liang，JIA Da-ping，LIU Fang

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract： Objective? To study the effect of autologous platelet-rich fibrin（PRF） on the survival of rabbit ear cartilage after transplantation， so as to provide evidence for clinical application. Methods? Sixteen New Zealand white rabbits were selected to design and strip out ear cartilage with similar size and shape and weight of 80mg on the symmetry of both ears. Both sides of ear cartilages were randomly divided into the control group and the experimental group. The piece of ear cartilage in control group was transplanted directly into the left side of the superficial fascia lacuna on the back of the rabbit ， the piece of ear cartilage in experimental group combine with PRF was transplanted into the right side of superficial fascia lacuna on the back of the rabbit. General observation， weight comparison and statistical analysis and staining which includ hematoxylin-eosin staining， saffron O staining and alcian blue staining were performed after 2 weeks， 4 weeks， 8 weeks and 12 weeks. Results? General observation and comparison of cartilage weight showed that： the weight of ear cartilage increased at 2-4 weeks， and decreased at 8-12 weeks. At each observation time， the weight of ear cartilage in the experimental group was greater than that in the control group. And the difference between the two groups was statistically significant （P<0.05）. Staining observation showed that：at each observation time， the chondrocytes in the experimental group were significantly more than those in the control group under the same microscopic scale and the same visual field. The heterochromatic cartilage matrix and blue glycosaminoglycan were more obvious in the experimental group. Conclusion? Autologous platelet-rich fibrin can promote the survival of rabbit ear cartilage after transplantation.

Key words： platelet-rich fibrin（PRF）; rhinoplasty; ear cartilage transplantation; absorbtion of cartilage; survival of cartilage; cytokines

整形美容行業(yè)近年來(lái)得到快速發(fā)展，其中鼻整形手術(shù)成為熱門手術(shù)之一。鼻整形手術(shù)通常應(yīng)用的手術(shù)方式有鼻假體置入術(shù)、鼻假體聯(lián)合耳軟骨隆鼻術(shù)、肋軟骨隆鼻術(shù)等[1]。由于單純假體置入容易引起感染、假體外露、包膜攣縮、透光等并發(fā)癥[2]，肋軟骨隆鼻手術(shù)存在血胸、氣胸、肋骨骨折、瘢痕形成甚至胸廓畸形等風(fēng)險(xiǎn)[3]，目前鼻假體聯(lián)合耳軟骨隆鼻術(shù)最為常用。然而，在臨床工作中，術(shù)者發(fā)現(xiàn)耳軟骨移植術(shù)后易出現(xiàn)軟骨成活不佳、被吸收等問(wèn)題，導(dǎo)致患者對(duì)術(shù)后遠(yuǎn)期鼻部形態(tài)不滿意。因此，改善耳軟骨移植后存活、減少其吸收成為鼻整形手術(shù)中急需解決的一大問(wèn)題。

富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）是由Choukroun等在2001年發(fā)現(xiàn)的第二代血小板濃縮物[4]。PRF能夠有效模擬生理狀態(tài)下血凝塊中的纖維蛋白形成過(guò)程，避免了免疫排斥和交叉感染的發(fā)生，有很好的生物相容性[5]。本課題組通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，PRF能夠促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合[6]，在骨缺損修復(fù)中可以誘導(dǎo)骨組織再生[7]，在脂肪移植中有促進(jìn)脂肪細(xì)胞存活的作用[8]。為進(jìn)一步探究PRF在耳軟骨移植方面是否同樣具有良好的應(yīng)用效果，本實(shí)驗(yàn)制作了新西蘭大白兔自體耳軟骨異位移植模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1? 材料和方法

1.1 研究對(duì)象：12～16周生長(zhǎng)雄性新西蘭大白兔16只，體重3.2～3.5kg，均購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，清潔級(jí)，普通環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，遵照安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用規(guī)定，動(dòng)物購(gòu)置后飼養(yǎng)3周。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：7%水合氯醛購(gòu)自青島宇龍海藻有限公司;2%鹽酸利多卡因注射液購(gòu)自上海朝暉藥品有限公司;鹽酸金霉素眼膏購(gòu)自北京雙言制藥有限公司;4%多聚甲醛固定液購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司;HE染色試劑購(gòu)自珠海BASO生物技術(shù)有限公司;番紅〇染色試劑、阿利新藍(lán)染色試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組：將每只實(shí)驗(yàn)兔雙側(cè)耳軟骨隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本數(shù)均為16。

1.3.2 PRF制備：自實(shí)驗(yàn)兔耳中動(dòng)脈以采血針抽取10ml血置入無(wú)菌玻璃干管中，立即以3 000r/min離心10min，可見(jiàn)血液分為三層，上層清亮液體為貧血小板血漿層，中層半透明凝膠狀物質(zhì)為PRF凝膠，底層為破碎紅細(xì)胞層（見(jiàn)圖1）。將試管放入4℃冰箱中冷藏30min后取出，取試管中層凝膠樣物質(zhì)放置于無(wú)菌紗布上，輕輕按壓擠出水分，使PRF成膜狀，PRF膜片即制備完成，備用。

1.3.3 制作兔耳軟骨移植模型：將實(shí)驗(yàn)兔稱重并記錄，7%水合氯醛注射液按3ml/kg自兔耳緣靜脈麻醉，麻醉成功后將兔雙側(cè)耳、頸背部剃毛備皮。于實(shí)驗(yàn)兔雙側(cè)耳背面對(duì)稱部位標(biāo)記擬取軟骨范圍，盡量避開(kāi)耳緣靜脈及中動(dòng)脈，防止剝離過(guò)程損傷血管。標(biāo)記完成后，常規(guī)消毒鋪巾，以稀釋后濃度為0.5%的利多卡因溶液沿標(biāo)記線行皮下注射起到局部腫脹及麻醉作用，腫脹完成后以11號(hào)尖刀片劃開(kāi)皮膚，用剝離子逐步剝離開(kāi)軟骨與皮膚，剝離完畢后以組織剪小心剪下軟骨，并去除軟骨表面軟骨膜，將兩側(cè)軟骨修剪至大小形狀相似、重量為80mg的軟骨塊（見(jiàn)圖2）。自兔背部皮膚以后正中線做兩側(cè)對(duì)稱小切口至淺筋膜層，分離出淺筋膜腔隙，將對(duì)照組耳軟骨塊直接置入左側(cè)背部淺筋膜腔隙內(nèi)，將制備好的PRF膜片和實(shí)驗(yàn)組耳軟骨塊共同放入右側(cè)背部淺筋膜腔隙內(nèi)，用絲線逐層縫合手術(shù)切口，術(shù)區(qū)涂抹鹽酸金霉素眼膏后處于暴露狀態(tài)，待麻醉恢復(fù)后放入原籠中，使之自由活動(dòng)，定期觀察術(shù)區(qū)情況。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況及組織大體外觀觀察：術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)兔活動(dòng)、進(jìn)食及手術(shù)切口的感染情況，于術(shù)后2周、4周、8周、12周以空氣針靜脈注射各處死4只實(shí)驗(yàn)兔，取出移植耳軟骨塊觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組耳軟骨塊增大或減小情況。

1.4.2 耳軟骨塊重量比較：于各時(shí)間點(diǎn)將移植耳軟骨塊取出后去除表面包膜進(jìn)行稱重并記錄。

1.4.3 組織學(xué)觀察：將移植耳軟骨塊標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定，脫鈣、梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，切片進(jìn)行HE染色、番紅〇染色、阿利新藍(lán)染色，在光鏡下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察，了解軟骨細(xì)胞成活、新生軟骨細(xì)胞數(shù)量及隨時(shí)間變化等情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先經(jīng)Levene齊性檢驗(yàn)方差滿足齊性要求。軟骨塊重量經(jīng)過(guò)單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 一般情況及大體觀察：所有實(shí)驗(yàn)兔在麻醉完全恢復(fù)后均能正?；顒?dòng)及飲食，無(wú)死亡，均進(jìn)入結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)兔耳部及背部手術(shù)切口均未出現(xiàn)感染，于擬定時(shí)間取出移植耳軟骨塊觀察，見(jiàn)各組移植耳軟骨塊表面光滑，邊界清晰，2～4周時(shí)可見(jiàn)兩組耳軟骨塊均增大，其中實(shí)驗(yàn)組增大更明顯，8～12周兩組耳軟骨塊均有所減小，其中對(duì)照組減小更為明顯。見(jiàn)圖3。

注：A～D.對(duì)照組分別于2周、4周、8周、12周取出的移植耳軟骨塊;E～H.實(shí)驗(yàn)組分別于2周、4周、8周、12周取出的移植耳軟骨塊

2.2 耳軟骨塊重量比較：由表1可知，2～4周時(shí)耳軟骨塊重量增加，8～12周時(shí)耳軟骨塊重量減少，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組耳軟骨塊重量均大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）與大體觀察結(jié)果相符。由此可知，PRF在術(shù)后12周內(nèi)可以促進(jìn)兔耳軟骨移植后成活，減少其吸收。

2.3 組織學(xué)觀察：對(duì)照組：2周時(shí)于耳軟骨塊邊緣出現(xiàn)新生軟骨細(xì)胞，其體積較小;4周、8周時(shí)見(jiàn)新生軟骨細(xì)胞形態(tài)逐漸增大、數(shù)量逐漸減少，12周時(shí)幾乎無(wú)新生軟骨細(xì)胞存在。實(shí)驗(yàn)組：2周時(shí)于耳軟骨塊邊緣出現(xiàn)大量新生軟骨細(xì)胞，其體積小、形態(tài)不規(guī)則呈多形性、排列紊亂;4周、8周時(shí)新生軟骨細(xì)胞增大，形態(tài)趨向成熟，排列較前規(guī)則;12周時(shí)可見(jiàn)組織新生軟骨細(xì)胞較2周時(shí)減少，但仍存在明顯新生軟骨細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比：各取材時(shí)間點(diǎn)在相同顯微倍數(shù)、同一個(gè)視野下實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，其中新生軟骨細(xì)胞也多于對(duì)照組（見(jiàn)圖4）;在番紅〇染色中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有明顯異染性軟骨基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組異染性軟骨基質(zhì)更多（見(jiàn)圖5）;在阿利新藍(lán)染色中，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組藍(lán)色的糖胺聚糖較對(duì)照組更明顯（見(jiàn)圖6）。

3? 討論

鼻假體聯(lián)合耳軟骨隆鼻術(shù)雖因其具有軟骨獲取簡(jiǎn)單、損傷較小、術(shù)后并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但仍然存在著軟骨成活不佳、被吸收等問(wèn)題。耳軟骨移植后被吸收的原因目前尚不明確，廖俊琳等[9]通過(guò)研究提出軟骨吸收的原因可能為：①軟骨塊脫離軟骨膜保護(hù)后缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng);②自身抗原的暴露，被軟骨基質(zhì)保護(hù)而未被機(jī)體識(shí)別的軟骨細(xì)胞暴露于免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)激活后發(fā)生清除作用。為進(jìn)一步解決軟骨移植后被吸收的問(wèn)題，有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞與軟骨顆粒混合、使用人類羊膜包裹軟骨可以減少軟骨吸收[10]，但由于脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)雜、人類羊膜獲取困難等原因限制了其臨床應(yīng)用。

PRF是一種富含纖維蛋白、白細(xì)胞和大量生長(zhǎng)因子的第二代血小板濃縮物。在電鏡下呈現(xiàn)出三分子立體疏松網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，類似于天然血凝塊，其疏松的結(jié)構(gòu)和較大的空隙有利于細(xì)胞因子的留存、細(xì)胞生長(zhǎng)及移行，從而延長(zhǎng)細(xì)胞因子的釋放和作用時(shí)間[11]。PRF活化后緩慢釋放出多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等[12]。多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合作用可提高軟組織修復(fù)能力，減輕炎癥反應(yīng)和水腫[13]，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖生長(zhǎng)以及軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)生成[14]，此外，其還可以誘導(dǎo)骨間質(zhì)干細(xì)胞增殖分化，提高成骨細(xì)胞蛋白激酶和骨保護(hù)素表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化及新骨形成能力[15-16]。國(guó)內(nèi)目前對(duì)PRF的研究主要集中于牙周組織及軟骨缺損修復(fù)等方面，如PRF聯(lián)合引導(dǎo)骨再生技術(shù)有利于促進(jìn)牙周病頜骨缺損患者植骨治療后骨組織修復(fù)及新生[17];PRF聯(lián)合自體軟骨顆粒能夠有效修復(fù)和縮小軟骨缺損[18]。然而，PRF在鼻整形手術(shù)方面的應(yīng)用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

在本研究中，課題組制作了兔自體耳軟骨異位移植模型，即將兔雙側(cè)耳軟骨塊隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別將單純耳軟骨塊、PRF聯(lián)合耳軟骨塊移置入背部淺筋膜腔隙內(nèi)，并在不同時(shí)間點(diǎn)取出耳軟骨塊進(jìn)行大體觀察、重量比較并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和組織學(xué)觀察。結(jié)果表明，PRF在耳軟骨移植術(shù)后12周內(nèi)可有效減少耳軟骨塊吸收，促進(jìn)耳軟骨塊成活。課題組結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析后認(rèn)為其機(jī)制可能有：①PRF釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)新生血管形成進(jìn)而為移植耳軟骨提供營(yíng)養(yǎng);②多種細(xì)胞因子共同作用減輕炎癥反應(yīng)從而降低了因周圍組織水腫對(duì)移植耳軟骨產(chǎn)生的擠壓應(yīng)力。本實(shí)驗(yàn)亦存在不足需要改進(jìn)之處：①由于時(shí)間限制，在本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)以上所述可能的機(jī)制進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;②本次實(shí)驗(yàn)最長(zhǎng)取材時(shí)間點(diǎn)為12周，12周后兩組耳軟骨塊重量將如何變化尚不可知;③PRF制備需要新鮮血液，單次抽取血液量與制備出PRF量非正相關(guān)，因此限制了PRF在臨床上的單次大量應(yīng)用。在后續(xù)研究中本課題組將進(jìn)一步完善對(duì)機(jī)制的研究，并探究PRF的保存方法，以期為臨床開(kāi)展更加完善的鼻整形手術(shù)提供新的理論依據(jù)。

綜上所述，自體富血小板纖維蛋白可以在耳軟骨移植術(shù)后12周內(nèi)減少耳軟骨吸收并促進(jìn)其成活，并且因其具有抗感染、減輕炎癥反應(yīng)和水腫的作用，可以考慮將其應(yīng)用于耳軟骨移植鼻整形術(shù)中以維持鼻部形態(tài)，提高患者滿意度。

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[收稿日期]2020-03-20

本文引用格式：高堂俊，趙宇，吳亮亮，等.富血小板纖維蛋白對(duì)兔耳軟骨移植成活情況的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（12）：97-101.