多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱致肝損傷時肝細(xì)胞線粒體的變化

康蘆兵 侯曉磊 張海寧

多烯紫杉醇是一種微管蛋白結(jié)合藥物，抗瘤譜廣，主要作用于卵巢癌、肺癌及乳腺癌等[1-3]，吉西他濱是一種二氟核苷酸類抗代謝藥物，主要破壞細(xì)胞的復(fù)制功能。在臨床使用多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱化療的過程中發(fā)現(xiàn)肝損傷的情況，且在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合使用后會導(dǎo)致動物肝臟細(xì)胞發(fā)生大量變性[4-6]，還可誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化造成細(xì)胞膜的損害[7-8]，但其機(jī)制研究尚不明確。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

雄性ICR小鼠體質(zhì)量18～20 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。

二、藥品及試劑

多烯紫杉醇及吉西他濱購于深圳萬樂制藥公司，批號分別為：2009041，20091001；ALT、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛定量試劑盒采購于南京建成生物公司。

三、儀器

恒溫水浴鍋購于金壇醫(yī)療儀器公司，Baujahr低溫離心機(jī)購于上海博星公司，8430紫外-可見分光光度計(jì)購于惠普公司。

四、分組及給藥

將40只小鼠隨機(jī)分為四組：正常對照組、低劑量給藥組、中劑量給藥組及高劑量給藥組，靜脈連續(xù)注射5 d后對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，正常對照組采用等劑量的生理鹽水注射。

五、生化指標(biāo)的檢測

研究在不同射擊工況下的彈丸膛內(nèi)運(yùn)動規(guī)律，對彈丸裝藥的設(shè)計(jì)和彈炮匹配性設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義，未來將對不同磨損程度的身管內(nèi)彈丸運(yùn)動規(guī)律作進(jìn)一步的研究。

小鼠采用眼眶取血，取血后經(jīng)3 000 r/min離心10 min，分離血清檢測ALT。取肝組織0.2 g，用生理鹽水制成組織勻漿，用于測定超氧化物歧化酶、丙二醛及谷胱甘肽，另取0.3 g肝組織制備線粒體，將肝組織勻漿，采用梯度離心法提取線粒體并用考馬斯亮藍(lán)檢測線粒體蛋白濃度。

六、線粒體膜電位測定

使用RH123標(biāo)記線粒體膜電位，測定膜電位值，在25 ℃條件下，將線粒體提取液與0.3 μmol/L的RH123共同孵育3 min，用測定液細(xì)兩次后，離心重懸，用熒光分光光度計(jì)測定線粒體懸液的熒光強(qiáng)度，熒光越弱表明膜電位值越低。

七、線粒體腫脹程度的檢測

線粒體的腫脹程度測定主要根據(jù)線粒體懸液在波長540 nm處的D值進(jìn)行判定。將制備的肝臟線粒體按照0.5 mg/mL重懸于線粒體緩沖液，在30 ℃的條件下，加入50 μmol/L的鈣離子，每隔2 min測定一次D值的降低，測定5次，D值越大表明線粒體腫脹程度越大。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.4進(jìn)行分析。組間差異的檢測采用SNK-Q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱處理的小鼠，血清ALT含量較對照組小鼠有顯著升高，對照組為(35.41±3.79)U/L, 低劑量組為 (52.79±4.13)U/L，中劑量組為(72.43±5.23)U/L，高劑量組為(102.95±5.73)U/L，給藥組與對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱用藥量的增加其ALT含量呈上升趨勢。

二、多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟的氧化功能受損

與正常對照組小鼠相比，多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱的小鼠肝組織中丙二醛的含量明顯增高，且隨著給藥量的增加，丙二醛的增高更明顯，同時給藥組小鼠的谷胱甘肽及超氧化物歧化酶較對照組小鼠呈顯著降低趨勢，該趨勢不隨藥量的增加而增加。見表1。

三、多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱對小鼠肝臟線粒體膜電位的影響

經(jīng)過多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱處理后小鼠的RH123熒光強(qiáng)度較正常對照組小鼠的23.13分別降低到20.38、18.13和14.25，隨著給藥劑量的增大，線粒體的膜電位呈現(xiàn)下降的趨勢。

表1 不同給藥量對小鼠氧化功能的影響

注：與對照組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05；與中劑量組相比，&P<0.05

四、多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱對小鼠肝臟線粒體腫脹程度的影響

由圖1可以看出，在波長為540 nm處，對線粒體懸液D值的分次檢測可以發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L的鈣離子可以誘導(dǎo)正常的線粒體發(fā)生細(xì)胞腫脹，第5次的D值下降值為0.435，用藥組小鼠的第5次D值下降分別為0.725、0.873和0.791，其D值下降程度與給藥劑量無相關(guān)性。

圖1多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱對50 μmol/L鈣離子誘導(dǎo)的線粒體腫脹的影響

討 論

多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱是一個被廣泛應(yīng)用的化療方案，而該項(xiàng)化療方案的應(yīng)用同時也對肝臟造成了一定損害，目前有研究表明，在大鼠靜脈注射多烯紫杉醇3周后出現(xiàn)肝細(xì)胞變性，丙二醛升高，還原性谷胱甘肽及超氧化物歧化酶減少[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，在對小鼠進(jìn)行多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱處理后，丙二醛含量升高且超氧化物歧化酶及還原型谷胱甘肽含量下降，表明多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱對肝損傷可能與氧化應(yīng)激有一定相關(guān)性，即氧化與抗氧化平衡被破壞，超氧化物歧化酶及還原型谷胱甘肽屬于抗氧化防御體系的重要組成部分，二者的降低表明抗氧化防御體系功能的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧增加，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而表現(xiàn)出丙二醛的增多，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，肝功能下降。在對線粒體膜電位進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量的增大，線粒體膜電位呈下降趨勢，經(jīng)過藥物處理后線粒體的腫脹程度明顯增加，推測多烯紫杉醇聯(lián)合吉西他濱能夠影響線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的氧化、抗氧化平衡破壞，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生壞死，肝功能受損。