不同乳桿菌緩解慢性酒精性肝損傷的作用比較

朱詩雅，翟齊嘯，趙星，孫新凱，路江浩，李華文，趙建新，張灝，田豐偉*，陳衛(wèi)

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)3(河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊，050800)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)，是全球慢性肝病的主要原因，包括從肝臟脂肪變性到酒精性肝炎、纖維化、肝硬化和肝細胞癌發(fā)展的一系列肝損傷疾病[1]。隨著經(jīng)濟水平的提高和社交活動的增多，全世界范圍內(nèi)尤其發(fā)展中國家的人均酒精消耗量逐年上升，國內(nèi)外酒精性肝病患者也日益增多。而在我國，酒精性肝病已經(jīng)上升成為僅次于乙型病毒性肝炎的導致肝硬化的第二大病因[2]。因此，探討酒精性肝病的發(fā)病機制及防治措施具有十分重要的意義。酒精性肝損傷的發(fā)病機制十分復雜，主要是乙醇及其衍生物乙醛等在代謝過程中直接或間接導致的氧化應激、腸源性內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)和炎癥反應等多種因素相互作用的結果[3-6]。其中，腸道屏障功能受損引起的腸源性內(nèi)毒素血癥及內(nèi)毒素激活枯否細胞(kupffer cells)在ALD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[7-8]。

益生菌已被證實具有調(diào)節(jié)生理活性、維持腸道微生態(tài)平衡、降低膽固醇水平、提高抗氧化能力、改善機體免疫功能等多種功能，目前已被廣泛應用于發(fā)酵乳制品、乳飲料、果汁、嬰兒食品以及藥品等領域，并得到廣大消費者及醫(yī)療工作者的認可[9]。已有臨床研究表明，酒精性肝損傷患者通過服用益生菌，腸道微生態(tài)恢復平衡，肝臟功能得到明顯改善[10]。目前雖然已經(jīng)有許多學者關注到益生菌對慢性酒精性肝損傷的作用，包括LactobacillusrhamnosusR0011[11]、LactobacillusplantarumLC27[12]、BifidobacteriumlongumLC67[12]、LactobacillusrhamnosusCCFM1107[13]、Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisKV9[14]等，但仍主要集中在利用鼠李糖乳桿菌LGG(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)對其機制進行研究，對其他菌株的篩選及方法研究較少。

乳酸菌具有提高免疫力、降低膽固醇、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能[15]。某些乳酸菌可通過減輕氧化應激、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道通透性等方面緩解酒精引起的肝功能損傷[16]。乳桿菌屬是目前發(fā)酵行業(yè)應用較多的一類乳酸菌，包括鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌等近10個種。有研究顯示，雖然都屬于乳桿菌屬，但不同種甚至同一種的乳桿菌其功能也不盡相同[17-18]。本研究選取幾株不同種類的乳桿菌，通過小鼠試驗研究比較不同乳桿菌對慢性酒精性肝損傷的緩解作用，并探討其緩解慢性酒精性肝損傷的機制，為相關產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。其中，植物乳桿菌LP45已被證實具有降低膽固醇、提高免疫力、抑制胃腸道致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能[19-22]。此外，鼠李糖乳桿菌L519分離自云南傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，瑞士乳桿菌L551(Lactobacillushelveticus551，L551)分離自西藏那曲傳統(tǒng)奶制品，以及副干酪乳桿菌L577(Lactobacillusparacasei577，L577)，均為具有較好體外性能的潛力菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

鼠李糖乳桿菌L519、植物乳桿菌LP45、瑞士乳桿菌L551、副干酪乳桿菌L577，河北一然生物技術有限公司；鼠李糖乳桿菌LGG，美國菌種保藏中心。

1.1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠80只，雄性，8周齡，體重18～20 g，上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、無水乙酸鈉、NaCl、多聚甲醛、無水乙醇等，國藥集團化學試劑有限公司；脫脂乳粉，市售，上海恒天然商貿(mào)有限公司；Lieber DeCarli液體飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司；葵花牌護肝片，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司；丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；小鼠內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6、白細胞介1β的ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；日本TOMY SX-700全自動高壓滅菌鍋，上海鼎謙生物科技有限公司；PB3002-N電子天平和EL204分析電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；GRP-9080恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；5424R小型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津制造所；MB100-2A微孔板恒溫振蕩器，杭州奧盛儀器有限公司；MULTISCAN GO全波長自動酶標儀，美國Thermo fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及處理

將凍存的4株乳桿菌復蘇、活化2代后，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，在4℃下6 000 r/min離心10 min，棄去上清，所得菌體用滅菌的生理鹽水洗滌并離心3次后，以質(zhì)量分數(shù)為12%的脫脂乳作為保護劑，凍干濃縮成菌粉。灌胃小鼠前，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水重懸，調(diào)整菌液濃度為1.0×109CFU/mL，在37 ℃水浴中復蘇30 min后使用。

1.3.2 動物模型的建立

SPF級健康C57BL/6雄性小鼠80只，8周齡，適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分成8組，每組10只。采用含35%熱量酒精(alcohol-fed，AF)或等熱量麥芽糊精(pair-fed，PF)的Lieber DeCarli液體飼料飼喂，連續(xù)喂養(yǎng)8周[23]。第1組：空白對照組(PF)；第2組：酒精模型組(AF)；第3組：陽性藥物對照組(AF+藥)；第4組：LGG陽性對照組(AF+LGG)；第5組：鼠李糖乳桿菌L519干預組(AF+L519)；第6組：植物乳桿菌LP45干預組(AF+LP45)；第7組：瑞士乳桿菌L551(AF+L551)；第8組：副干酪乳桿菌L577干預組(AF+L577)。第1組，攝食量與第2組等量喂養(yǎng)(以等熱量麥芽糊精代替酒精)。第3、4、5、6、7、8組，最后2周添加護肝片溶液或菌懸液。所有樣品按照10 mg/kg體重進行灌胃[16]。每天測定小鼠的食物攝入量，每周測定小鼠體重1次。小鼠喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，麻醉后摘眼球取血，輔以頸椎脫臼法處死，收集血液和組織樣本。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 肝組織病理學觀察

取小鼠肝臟左葉同一位置的組織，用質(zhì)量分數(shù)為10%的多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)過石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染料染色后，在切片掃描儀下掃片觀察。

1.3.3.2 相關生化指標測定

小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，均利用全自動血清生化分析儀進行測定。肝勻漿中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和丙二醛的測定，均按照相應試劑盒具體操作說明進行。

1.3.3.3 血清內(nèi)毒素含量測定

血清中內(nèi)毒素的含量測定采用酶聯(lián)免疫分析法，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3.3.4 肝臟炎癥因子表達測定

肝臟中炎癥因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6的表達水平均采用ELISA試劑盒檢測。

1.3.3.5 腸道緊密連接蛋白mRNA表達水平測定

采用Trizol法提取腸道組織中總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，最后對腸道中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達水平進行實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)分析。

1.3.3.6 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±均值標準誤差(mean±SEM)表示。兩組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計分析采用獨立樣本T檢驗，多組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計分析采用One-Way Aonva單因素方差分析。當P<0.05時，視為組間具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟組織病理損傷的影響

長期大量飲酒導致的慢性酒精性肝損傷，初期通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝。如圖1所示，慢性酒精暴露對小鼠肝臟造成了嚴重的病理損傷。對照組肝細胞結構較完整，有明顯的界線且胞漿均勻，有輕微脂肪空洞，無炎性浸潤；而造模組脂肪變性明顯，有大片的脂肪空洞，肝細胞腫脹變形，有網(wǎng)狀結構，出現(xiàn)炎性細胞浸潤；乳桿菌干預則有效地緩解了這些病理損傷，表現(xiàn)為脂肪泡減少，炎癥細胞浸潤減輕。其中，鼠李糖乳桿菌L519、植物乳桿菌LP45和瑞士乳桿菌L551效果較為顯著，肝細胞恢復正常，而副干酪乳桿菌L577效果較差，肝細胞仍腫脹變形，存在脂肪空泡。

a-PF組：b-AF組；c-AF+藥組；d-AF+LGG組；e-AF+L519組；f-AF+LP45組；g-AF+L551組；h-AF+L577組圖1 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟組織病理損傷的影響Fig.1 Effects of Lactobacillus treatment on pathological injuryof liver tissue in mice exposed to chronic alcohol(H&E,×200)

2.2 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶含量的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)主要存在于肝細胞胞漿內(nèi)，當肝臟受到損傷時，細胞胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶進入血液，導致血液中ALT和AST的含量升高[24]。對小鼠血清中ALT和AST的活性進行分析，結果如圖2所示，慢性酒精暴露導致小鼠血清中ALT和AST活性顯著升高，且AST的含量大幅上升，明顯高于ALT，而乳桿菌干預后可以有效恢復ALT、AST的活性。其中，植物乳桿菌LP45和瑞士乳桿菌L551效果最為顯著，表明植物乳桿菌LP45和瑞士乳桿菌L551能夠有效抑制慢性酒精肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的升高。

a-小鼠血清中ALT變化;b-小鼠血清中AST變化圖2 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠血清中ALT和AST變化的影響Fig.2 Effects of Lactobacillus treatment on serum ALT and ASTlevels in mice exposed to chronic alcohol注：# P<0.05表示與PF組比較，具有顯著差異；*P<0.05表示與AF組比較，具有顯著差異。

2.3 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟中氧化指標的影響

自由基及其誘導的脂質(zhì)過氧化是造成肝臟組織損傷的重要原因之一。正常情況下，細胞內(nèi)存在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過氧化氫酶、和VE等抗氧化劑，可以有效清除自由基，維持體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)平衡[25]。但大量飲酒會破壞這種平衡，誘發(fā)氧化應激，導致脂質(zhì)過氧化，抗氧化物質(zhì)SOD、GSH等大量消耗，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)增高，從而導致肝臟發(fā)生病變，各種生化指標出現(xiàn)異常[26-27]。對小鼠肝臟中氧化指標進行分析，結果如圖3所示，慢性酒精處理后，與對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟中MDA濃度明顯升高，而GSH含量和SOD活性顯著降低。相對于模型組，乳桿菌干預可以有效地降低MDA濃度，并恢復了GSH含量和SOD活性。其中，植物乳桿菌LP45表現(xiàn)最為突出。表明植物乳桿菌LP45能夠有效抑制慢性酒精引起的氧化損傷。

a-小鼠肝臟中MDA變化;b-小鼠肝臟中GSH變化;c-小鼠肝臟中SOD變化圖3 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟中MDA、GSH、SOD變化的影響Fig.3 Effects of Lactobacillus treatment on liver MDA, SOD and GSH levels in mice exposed to chronic alcohol

2.4 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠血清內(nèi)毒素含量的影響

內(nèi)毒素是來自腸道革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分，具有十分廣泛的生物活性，過量時能夠引起嚴重的炎癥反應[28]。研究表明，酒精導致腸道屏障受損，大量腸源性LPS進入肝臟與kupffer細胞結合，引發(fā)一系列炎癥反應，從而導致肝臟損傷[29]。對小鼠血清中LPS含量進行分析，由圖4可知，慢性酒精處理后，酒精模型組小鼠血清中LPS含量明顯升高，而乳桿菌攝入后顯著降低了LPS含量。同時，本研究使用的Lieber-DeCarli標準型酒精液體模型飼料是一種高脂肪的酒精液體飼料，其中，脂肪熱量高達35%[30]。對照液體飼料和酒精液體飼料等熱量喂養(yǎng)，因此，長期喂養(yǎng)后對照組可能出現(xiàn)輕微的非酒精性脂肪肝，導致血清中LPS水平略高于正常水平，而乳桿菌攝入后顯著降低了LPS水平，甚至恢復略低于對照組的正常水平。表明所選乳桿菌均能夠有效抑制慢性酒精引起的血清中LPS含量的升高。

圖4 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠血清中LPS變化的影響Fig.4 Effects of Lactobacillus treatment on serum LPS levels in mice exposed to chronic alcohol

2.5 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟中炎癥因子含量的影響

促炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)是誘導酒精性肝損傷的關鍵因素之一，參與肝臟炎癥反應、脂肪變性和細胞凋亡過程[31]。對小鼠肝臟中炎癥因子含量進行分析，由圖5可知，慢性酒精處理后，小鼠肝臟中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯增加，而乳桿菌處理后大大降低了TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。同時，本研究使用的Lieber-DeCarli標準型酒精液體模型飼料，對照組可能出現(xiàn)輕微的非酒精性脂肪肝，對照組可能出現(xiàn)輕微的非酒精性脂肪肝，導致組織中IL-1β和IL-6水平略高于正常水平，而乳桿菌攝入后顯著降低了IL-1β和IL-6水平，甚至恢復略低于對照組的正常水平。其中，鼠李糖乳桿菌L519效果最為顯著。表明鼠李糖乳桿菌L519能夠顯著抑制慢性酒精引起的肝臟中炎癥因子含量的升高。

2.6 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠腸道緊密連接蛋白表達水平的影響

緊密連接(tight junction，TJ)是腸黏膜上皮細胞間最重要的連接方式，對維持黏膜上皮細胞極性及調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著重要作用，用以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[32]。其中，外周蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)、密封蛋白1(claudin-1)、閉合蛋白(occludin)是構成緊密連接的重要成分[33]。對ZO-1、claudin-1、occludin的mRNA表達情況進行分析，由圖6可知，慢性酒精處理后，小鼠腸道中ZO-1、claudin-1、occludin的mRNA表達水平明顯降低，而乳桿菌處理后得到恢復。其中，鼠李糖乳桿菌L519和植、物乳桿菌LP45效果最為顯著。表明鼠李糖乳桿菌L519和植物乳桿菌LP45能夠有效改善慢性酒精引起的腸道緊密連接蛋白表達水平的降低。

a-小鼠肝臟中TNF-α變化;b-小鼠肝臟中IL-1β變化;c-小鼠肝臟中IL-6活性變化圖5 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠肝臟中TNF-α, IL-1β, IL-6變化的影響Fig.5 Effects of Lactobacillus treatment on liver TNF-α, IL-1β, IL-6 levels in mice exposed to chronic alcohol

a-小鼠腸道中ZO-1變化;b-小鼠腸道中claudin-1變化;c-小鼠腸道中Occludin變化圖6 乳桿菌對慢性酒精暴露小鼠腸道緊密連接蛋白表達水平的影響Fig.6 Effects of Lactobacillus treatment on intestinal tight junction protein expression levels in mice exposed to chronic alcohol

3 討論

長期大量飲酒會引起酒精性肝損傷，包括從酒精性脂肪肝到酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)展的一系列肝損傷疾病[1]。先前的大量研究已表明，氧化應激在酒精性肝損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮著極為重要的作用[25,34]。近來研究也表明，腸道屏障功能受損引起的腸源性內(nèi)毒素血癥是導致酒精性肝損傷的關鍵因素之一[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷患者血漿中的內(nèi)毒素水平顯著高于正常人[8]，酒精、內(nèi)毒素和肝損傷之間的關系日趨明顯。同時，大量研究表明，酒精會導致腸道屏障功能受損，腸道對內(nèi)毒素的通透性增加[35]，導致內(nèi)毒素從腸道轉(zhuǎn)移到肝臟，從而激活kupffer細胞，引發(fā)一系列導致炎癥反應和肝損傷的事件[36]。本研究結果同樣顯示，慢性酒精暴露引起小鼠肝臟中形成大量的脂肪積累，肝臟氧化損傷增加，腸道通透性顯著增加，血液中內(nèi)毒素含量顯著上升，肝臟炎癥水平增加。

益生菌具有抗氧化、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道屏障功能等功能。研究表明，益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，刺激腸道生長和黏膜免疫活性，增強腸黏膜上皮細胞間的緊密連接[37]，改善腸道屏障功能[38]，從而減輕腸源性內(nèi)毒素血癥，緩解酒精性肝損傷。同時，已有研究表明鼠李糖乳桿菌LGG處理能夠顯著抑制廣譜產(chǎn)生內(nèi)毒素的革蘭氏陰性菌的生長，從而降低酒精引起的內(nèi)毒素增加[39]，抑制肝臟炎癥反應[40-41]。

本研究結果表明，所選乳桿菌均能夠一定程度地改善慢性酒精引起的小鼠肝損傷。其中，植物乳桿菌LP45能夠有效抑制慢性酒精引起的氧化損傷以及肝臟炎癥反應，并有效改善腸道緊密連接，這可能與其已被證實的降低膽固醇、提高免疫力、抑制胃腸道致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能有關[19-22]。同樣，鼠李糖乳桿菌L519也能夠顯著抑制慢性酒精引起的肝臟炎癥反應，并有效改善腸道緊密連接。同時，本研究結果也進一步驗證，所選乳桿菌尤其鼠李糖乳桿菌L519和植物乳桿菌LP45，能夠通過改善腸道緊密連接蛋白表達的降低，修復腸上皮屏障功能受損，同時降低酒精引起的內(nèi)毒素增加，進而阻止腸道內(nèi)毒素泄漏，減輕腸源性內(nèi)毒素血癥，緩解小鼠肝臟氧化損傷以及炎癥反應，從而改善酒精性肝損傷。