藍莓花青素微膠囊制備及其性質(zhì)分析

郭娜，朱桂蘭，劉興運，張方艷，王子迎，楊俊杰，陳麗君

(合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥，230061)

花青素是一種黃酮類水溶性天然色素，具有抗氧化、延緩衰老等功能，在食品和化妝品等行業(yè)有巨大潛力，但其穩(wěn)定性較差，易受溫度、pH值、光照等條件影響，因而限制了其使用范圍[1-3]。研究表明通過微膠囊技術(shù)包封、花青素?；吞砑虞o色劑等技術(shù)方法可以顯著提高花青素的穩(wěn)定性[4-7]。

GIUSTI[6]以海藻酸鈉-果膠包裹紫玉米和藍莓提取物，包埋處理明顯降低了花青素色苷的光降解率。CHEN等[7]使用殼聚糖-硫酸軟骨素包埋接骨木花青素，獲得包埋率較高的微膠囊，并改善了花青素的抗氧化活性和貯藏穩(wěn)定性。ELIF等[8]使用殼聚糖和明膠作為壁材，以黑胡蘿卜提取物為芯材，制備微膠囊，并進行了體外釋放實驗，結(jié)果表明殼聚糖含量限制了黑胡蘿卜花青素的釋放[8]。陳虎等[9-13]研究了玫瑰花、黑米花青素的包埋，分別優(yōu)化了其工藝條件，對微膠囊工藝優(yōu)化和探索花青素微膠囊穩(wěn)定性有重要意義。

微膠囊技術(shù)能夠提高花青素的穩(wěn)定性和控制其釋放作用，是比較流行的一種包埋手段[5,7，14-19]。本論文采用銳孔法制備藍莓花青素微膠囊，并進行體外模擬釋放和貯藏穩(wěn)定性研究，以期提高藍莓花青素穩(wěn)定性，為藍莓花青素的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓果，合肥師范學院藍莓基地；矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品，合肥博美生物科技有限責任公司；海藻酸鈉，青島明月海藻集團有限公司；胃蛋白酶，上海聚源生物科技有限公司；CaCl2，天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計，島津有限公司；S4800掃描電子顯微鏡，日本日立公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；DHZ-DA恒溫振蕩器，蘇州市培英實驗設備有限公司；PHS pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SHZ-D3真空泵，上海鵬奕儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 花青素含量測定

以矢車菊素-3-葡萄糖苷作為花青素標準品，測定其標準曲線[12]。

準確稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷，用V(HCl)∶V(甲醇)=1∶9，定容，得到質(zhì)量濃度為5.0、10.0、15.0、20.0及25.0 μg/mL的標準溶液，然后在520 nm波長下測其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，矢車菊素-3-葡萄糖苷濃度(C)為標準曲線的橫坐標，線性擬合得到標準曲線方程：

C=47.518A+1.352 7,R2=0.994 1

(1)

式中：A為520nm處吸光度；C為花青素質(zhì)量濃度(μg/mL)。

1.3.2 藍莓花青素微膠囊制備

藍莓果經(jīng)粉碎，過60目篩，在體積分數(shù)70%乙醇提取2 h，過濾并40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥獲得藍莓花青素凍干粉，4 ℃保存。

芯材：使用藍莓花青素凍干粉配制成質(zhì)量濃度0.73 g/L的溶液。

壁材：分別稱取不同質(zhì)量的海藻酸鈉，加水溶解，60 ℃下水浴并攪拌至完全溶解，冷卻至室溫后定容，配制成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液。

按照芯材溶液和壁材溶液體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6混合均勻，避光靜置消泡，得到芯壁材混合溶液。

用不同針頭孔徑的無菌注射器進行造粒制珠，將芯壁材混合溶液緩慢滴入到一定質(zhì)量濃度的CaCl2溶液中，形成圓形微膠囊顆粒[13]。

微膠囊顆粒經(jīng)過循環(huán)式真空泵抽濾至無水滴落，用蒸餾水洗滌3次并進行抽濾。在520 nm波長下測量濾液的吸光度，并根據(jù)花青素的標準曲線計算出濾液中花青素含量，按公式(2)計算出藍莓花青素微膠囊化的包埋率。以矢車菊素-3-葡萄糖苷作為花青素標準品，測定其標準曲線[12]。

(2)

式中：W，藍莓花青素包埋率，%；C1，原液花青素質(zhì)量濃度，g/L；V1，原液體積，mL；C2，濾液花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V2，濾液體積，mL。

1.3.3 藍莓花青素微膠囊體外模擬試驗

準確移取制備的藍莓花青素微膠囊，分別加入到60 mL胃模擬液和60 mL小腸模擬液中[5,18]。在水浴恒溫振蕩器中37 ℃，65 r/min條件下反應，每隔0.5 h測1次吸光度，按公式(3)計算花青素釋放率。

(3)

式中：δ，藍莓花青素釋放率，%；C3，原液花青素的質(zhì)量濃度，g/L；V3，原液體積，mL；C4，模擬液花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V4，模擬液體積，mL；W，藍莓花青素包埋率，%。

1.3.4 藍莓花青素微膠囊穩(wěn)定性試驗

1.3.4.1 pH對藍莓花青素微膠囊影響

準確稱取負載有等量花青素的微膠囊與花青素粉末，分別置于20 mL不同pH值的緩沖液中，記錄溶液隨時間的顏色變化，并分析2 d后的花青素保存率?；ㄇ嗨乇４媛拾凑展?4)計算：

(4)

式中：η，藍莓花青素保存率，%；A0，處理前吸光度；A1，處理后吸光度。

1.3.4.2 溫度對藍莓花青素微膠囊影響

準確稱取負載有等量藍莓花青素的微膠囊，分別置于pH值為3.0的緩沖液中，緩沖液體積為60 mL，分別置于10、20、40、70、95 ℃條件下，每隔30 min測定花青素含量，按公式(4)計算花青素保存率。

1.3.5 藍莓花青素微膠囊電鏡分析

取適量負載藍莓花青素微膠囊固定并噴金處理，觀察其放大800倍的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用軟件Origin 8.5和SPSS 24進行分析，結(jié)果用平均值±標準差來表示，每組試驗平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓花青素微膠囊制備

2.1.1 芯壁材比例與海藻酸鈉對微膠囊包埋率的影響

芯壁材比例(V∶V)與海藻酸鈉質(zhì)量濃度對藍莓花青素微膠囊化包埋率影響如圖1所示。

圖1 芯壁材比例和海藻酸鈉濃度對微膠囊化包埋率影響Fig.1 Effect of ratio of core material to wall material and sodium alginate on the encapsulation rate of microcapsules

由圖1分析可知，芯壁材比例和海藻酸鈉濃度對藍莓花青素微膠囊化的包埋率影響顯著(P<0.05)?；ㄇ嗨匚⒛z囊化包埋率隨芯壁材比例增大先升高后下降，且芯壁材體積比為1∶2時，藍莓花青素微膠囊包埋的效率達到最高值84.00%。這可能是芯壁材比例較大時，混合溶液較稀，制備的微膠囊呈扁圓形、質(zhì)地松軟，包埋花青素效率低；芯壁材比例較小時，溶液較黏稠，所需固化時間長，使得藍莓花青素溶于固化液，藍莓花青素的包埋率較低，且成型效果差，微膠囊易拖尾。因而藍莓花青素的微膠囊化宜選擇的芯壁材最佳比例為1∶2。

隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度增大，藍莓花青素微膠囊化包埋率升高。當海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL時，藍莓花青素微膠囊化包埋率達到峰值，為87.00%，微膠囊顆粒均勻，整體外觀為球狀。海藻酸鈉質(zhì)量濃度超過1.5 g/100 mL時，藍莓花青素微膠囊化包埋率下降顯著，可能是海藻酸鈉濃度較高導致其溶液黏度大，流動性變差，制備難度增加，微膠囊拖尾現(xiàn)象明顯，影響微膠囊的成型，從而使得藍莓花青素包埋率下降，這一結(jié)果與楊艷等[16]制備的微膠囊的針頭孔徑影響規(guī)律基本一致。

2.1.2 CaCl2與針孔尺寸對微膠囊包埋率影響

CaCl2與針孔尺寸對藍莓花青素微膠囊化的包埋率影響均顯著(P<0.05)，其結(jié)果如圖2所示。藍莓花青素微膠囊化的包埋率隨CaCl2濃度的增加而提高，當CaCl2為1.5 g/100 mL時，藍莓花青素的包埋率達到最大值為89.37%；繼續(xù)增大濃度后，藍莓花青素微膠囊化包埋率反而降低。這可能是由于CaCl2濃度影響微膠囊成型效果，CaCl2濃度較低時制備的微膠囊產(chǎn)品質(zhì)地松軟，極易破碎，而濃度較高時，形成海藻酸鈣層結(jié)構(gòu)較為致密，但內(nèi)部網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)分布不均勻[10]，也不利于微膠囊產(chǎn)品的干燥加工。

圖2 CaCl2與針孔尺寸對微膠囊化包埋率影響Fig.2 Effect of CaCl2 and needle diameter on the encapsulation rate of microcapsules

針頭孔徑影響制備的微膠囊直徑大小，也直接影響微膠囊的包埋率。隨著針頭孔徑增大，藍莓花青素微膠囊化的包埋率增加，針頭孔徑為0.60 mm時，藍莓花青素微膠囊包埋率達到最大值88.58%；針頭孔徑繼續(xù)增大時，藍莓花青素微膠囊化的包埋率反而下降，這可能是由于針頭孔徑增大使微膠囊表面積增大，從而可以容納更多的花青素，但微膠囊在CaCl2溶液中固化時間增長，藍莓花青素溢出的量增加，從而降低了包埋率。綜上分析可知，最佳制備藍莓花青素微膠囊的注射器針頭孔徑為0.60 mm。

綜上可知，藍莓花青素微膠囊最佳試驗組合方案為芯材和壁材比例為1∶2、海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、CaCl2濃度1.5 g/100 mL、針頭孔徑0.60 mm。對最佳條件進行驗證，結(jié)果表明該試驗條件下藍莓花青素微膠囊包埋率達到90.17%。

2.2 花青素微膠囊掃描電鏡

由圖3掃描電鏡圖可知，藍莓花青素微膠囊外觀呈球狀，微膠囊外觀除部分凹凸不平和塌陷外，整體飽滿充實完整，其表面光滑連續(xù)性好，無破裂現(xiàn)象和裂痕出現(xiàn)，表明海藻酸鈉用作包埋藍莓花青素的壁材，可以起到很好的支撐作用。

圖3 花青素微膠囊微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM of the anthocyanin microcapsule

2.3 藍莓花青素體外模擬試驗

由圖4可知，藍莓花青素微膠囊在模擬胃液環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，并且藍莓花青素釋放率低。藍莓花青素微膠囊在胃模擬液中的花青素在0～2 h時釋放率升高，2 h以后，花青素的釋放率保持平緩，釋放率達到最高值25.17%。在小腸液體外模擬試驗中，花青素釋放率在4 h時，花青素基本完全釋放，繼續(xù)延長時間，花青素釋放率趨于平穩(wěn)，微膠囊花青素的釋放率最高89.26%。

圖4 藍莓花青素微膠囊產(chǎn)品體外模擬釋放試驗Fig.4 Release curve of the anthocyanin microcapsule in vitro

綜上分析可知，海藻酸鈉作為1種腸溶性壁材，有較好的耐酸性和腸溶性，可以起到控制花青素緩釋的作用。這一結(jié)果也與玫瑰茄花色苷微膠囊的釋放性規(guī)律一致[19]。

2.4 藍莓花青素微膠囊穩(wěn)定性試驗

2.4.1 pH值對藍莓花青素微膠囊影響

pH值對藍莓花青素微膠囊和穩(wěn)定性影響如圖5和圖6所示。

a-花青素微膠囊;b-花青素粉末；上排為初始，下排為2 d后圖5 pH值對藍莓花青素貯藏前后色澤的影響Fig.5 Effect of pH on color of blueberry anthocyanin before and after storage

圖6 pH值對藍莓花青素的貯藏穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of pH on storage stability of blueberry anthocyanin

由圖5可知，在pH值為3～12的緩沖液中，藍莓花青素微膠囊溶液顏色差異顯著(P<0.05)，這是由于藍莓花青素分子在不同pH值條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使溶液色澤發(fā)生變化。在pH值為3～6時，以紅色的黃烊鹽陽離子形式存在，隨著pH值增大逐步轉(zhuǎn)變成無色的假堿和查爾酮形式存在，pH>7后花青素以藍色醌型堿形式存在[20]，因而花青素在不同溶液中色澤不同，且其吸光度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。常溫貯藏2 d后，不同pH值條件下的微膠囊和粉末的花青素穩(wěn)定性如圖6所示。在pH值為3和8時，花青素微膠囊和花青素粉末狀保存率較高，且微膠囊后的花青素保存率高于粉末狀組，由此可知，花青素經(jīng)膠囊處理可以提高其穩(wěn)定性。花青素粉末在pH>8后，保存率下降，可能是花青素在強堿條件下發(fā)生降解所致。微膠囊化的花青素在pH值為9時仍有較高保存率，也說明了經(jīng)過微膠囊化處理可以提高花青素的穩(wěn)定性范圍。

2.4.2 溫度對藍莓花青素微膠囊的影響

如圖7所示，不同溫度下的花青素微膠囊穩(wěn)定性顯著不同(P<0.05)。在環(huán)境溫度低于20 ℃時，藍莓花青素較穩(wěn)定，隨著時間延長，藍莓花青素微膠囊的保存率基本保持不變；當溫度高于20 ℃時，微膠囊中藍莓花青素發(fā)生降解，花青素的保存率明顯下降；溫度越高，藍莓花青素降解速度越快，花青素的保存率越低。在溫度達到95 ℃，加熱3.0 h后，微膠囊中花青素的保存率下降到17.91%，同時對比未包埋組的花青素，可以看出花青素經(jīng)微膠囊處理后的保存率高于粉末狀花青素組數(shù)據(jù)，說明藍莓花青素經(jīng)微膠囊處理后對熱的穩(wěn)定性有所提高。

圖7 溫度對藍莓花青素貯藏穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of temperature on storage stability of anthocyanin

3 結(jié)論

藍莓花青素微膠囊的制備以花青素微膠囊化包埋率為指標，通過單因素試驗，確定藍莓花青素微膠囊制備最佳工藝條件為：芯材與壁材體積比為1∶2、海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、CaCl2質(zhì)量濃度1.5 g/100 mL、針頭孔徑0.60 mm，此條件下制備的藍莓花青素微膠囊包埋率最高。掃描電鏡顯示藍莓花青素微膠囊，其表面光滑完整，整體呈球狀結(jié)構(gòu)，微膠囊大小均勻。

藍莓花青素微膠囊體外模擬結(jié)果表明，以海藻酸鈉為壁材制備的藍莓花青素微膠囊有控制緩釋的作用，具有良好的耐酸性和腸溶性。在模擬胃液環(huán)境中，花青素的釋放率低，持續(xù)釋放2 h達到穩(wěn)定，釋放率達到25.17%；在模擬小腸液環(huán)境中，4 h內(nèi)花青素持續(xù)釋放，釋放率達到89.26%。

穩(wěn)定性試驗表明經(jīng)微膠囊處理后的花青素對pH值和溫度穩(wěn)定性均有提高。