Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體與自噬調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

楊根夢(mèng)，洪仕君，王一航，沈?qū)氂?，?浩，曾曉鋒，李利華

(昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院， 昆明 650500)

細(xì)胞自噬 (autophagy)分為3種不同的形式：小自噬 (microautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (chaperone-mediated autophagy)和大自噬 (macroautophagy)。通常所說(shuō)的自噬是指大自噬,其發(fā)生過(guò)程可分為4個(gè)階段：分隔膜的形成；自噬體的形成；自噬體的運(yùn)輸、融合；自噬體的降解。自噬由自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,Atg)進(jìn)行調(diào)控，截至目前為止，可作為自噬標(biāo)志物的基因有LC3、Beclin1、Atg5及Atg7等[1-3]。細(xì)胞自噬參與機(jī)體多種疾病如腫瘤，炎癥，神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等的調(diào)節(jié)。但自噬的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。

核因子NF-E2相關(guān)因子 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是機(jī)體抗氧化應(yīng)答反應(yīng)的核心途徑之一，Nrf2的缺失或激活障礙，會(huì)加重機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、破壞細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，引起細(xì)胞毒性，甚至死亡。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2的激活依賴于Keap1，Nrf2和Keap1 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體處于抑制狀態(tài)，并通過(guò)Keap1介導(dǎo)的泛素化對(duì)Nrf2 持續(xù)進(jìn)行降解以維持轉(zhuǎn)錄形成的Nrf2 之間的平衡[4]。p62，也稱SQSTM-1，是一種多面銜接蛋白，其主要功能是將泛素化的蛋白質(zhì)帶到蛋白酶體中進(jìn)行降解，p62對(duì)Keap1具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，Keap1/Nrf2/p62可參與中毒、腫瘤、凋亡和自噬等的調(diào)節(jié)[5-7]。NLRP3炎性小體是一種多聚體蛋白復(fù)合物，由NLRP3，ASC和pro-caspase-1組成。NLRP3炎性小體作為一種重要的促炎性細(xì)胞內(nèi)受體，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，NLRP3炎性小體可參與自噬的調(diào)節(jié)[8]。因此，本文主要從Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體與自噬的調(diào)節(jié)方面進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞自噬的雙重作用

在生理情況下，自噬主要是一種應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞的生存。但過(guò)度應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞自噬可看成是一種特殊形式的死亡。近年來(lái)，尤其是用Atg基因敲除研究，證實(shí)了細(xì)胞自噬與細(xì)胞死亡之間的相互關(guān)系。但到目前為止還不能斷定究竟是何種因素決定細(xì)胞自噬過(guò)程是保護(hù)作用還是毒性作用。細(xì)胞自噬與細(xì)胞生死之間具有復(fù)雜的關(guān)系，這種復(fù)雜性反映了細(xì)胞自噬在疾病調(diào)節(jié)中具有復(fù)雜多變的作用。激活自噬可作為抗氧化途徑，通過(guò)清除受損或功能失調(diào)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，對(duì)神經(jīng)退行性疾病和癌癥等具有保護(hù)作用[9-10]。在毒品濫用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可使大鼠多巴胺能細(xì)胞通過(guò)激活caspase-3促進(jìn)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明自噬對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用具有保護(hù)作用[11]。然而，有研究表明，甲基苯丙胺誘導(dǎo)自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的毒性作用[12-13]。說(shuō)明自噬對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)是一把“雙刃劍”，自噬一旦激活，必須在渡過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止，否則自噬過(guò)度激活將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。

2 Keap1/Nrf2/p62的結(jié)構(gòu)及相互調(diào)節(jié)作用

Keap1是Cul3-泛素E3連接酶復(fù)合物的銜接子,由 624個(gè)氨基酸組成，包括5個(gè)區(qū)，即NTR、BTB/POZ、IVR、DGR/Kelch 和CTR。Nrf2是機(jī)體較為重要的抗氧化防御體系，其發(fā)揮作用需要與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化酶和II相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，從而降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞、組織及器官造成的損傷[14]。Keap1對(duì)Nrf2具有負(fù)調(diào)控作用，正常情況下Keap1/Nrf2形成復(fù)合物定位于細(xì)胞質(zhì)中，Nrf2被Keap1-Cul3-E3泛素連接酶復(fù)合物泛素化并被26S蛋白酶降解以維持其穩(wěn)態(tài)水平，而處于抑制狀態(tài)。在應(yīng)激條件下，Keap1中的半胱氨酸殘基可發(fā)生修飾而使Keap1構(gòu)象發(fā)生改變，從而使Nrf2從Keap1/Nrf2復(fù)合物中分離出來(lái)，同時(shí)半胱氨酸殘基可抑制E3泛素連接酶的活性，使Nrf2不能泛素化和降解，最終激活Nrf2，激活的Nrf2從胞質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)，與小Maf蛋白形成二聚體，該二聚體可與ARE結(jié)合，激活抗氧化基因和蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)的作用[5,15-16]。p62主要功能是將泛素化的蛋白質(zhì)帶到蛋白酶體中進(jìn)行降解，此外，p62可通過(guò)LC3相互作用區(qū)與自噬標(biāo)志性蛋白LC3直接相互作用。因此，p62被認(rèn)為是泛素化蛋白和自噬之間的聯(lián)系[16]，同時(shí)，p62已廣泛作為自噬流的標(biāo)志。Keap1/Nrf2是抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子。p62也可調(diào)節(jié)Nrf2的活性，p62結(jié)構(gòu)中含有STGE序列可與Keap1中kelch結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而破壞Keap1/Nrf2復(fù)合物的穩(wěn)定性，使Nrf2從復(fù)合物中解離出來(lái)而激活Nrf2。由于p62可與LC3相互作用，因此Keap1/Nrf2/p62與自噬的調(diào)節(jié)具有相互作用。若p62異位表達(dá)或自噬缺陷，使p62與Keap1結(jié)合形成聚集體，使Nrf2泛素化和降解減少，而激活Nrf2，該過(guò)程稱為Nrf2激活的非經(jīng)典機(jī)制[5-7]。

3 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

Nod樣受體(nod-like receptor，NLRs)是一種細(xì)胞質(zhì)識(shí)別受體，主要負(fù)責(zé)IL-1β和IL-18的加工和釋放。截至目前為止，在人類中已發(fā)現(xiàn)22個(gè)NLR成員，小鼠中有34個(gè)，而根據(jù)它們N末端區(qū)域的不同分為NLRA，NLRB，NLRC和NLRP四個(gè)亞家族。其中NLRP3是研究最多且研究較為透徹的亞基[17-18]。NLRP3炎性小體作為一種重要的促炎性細(xì)胞內(nèi)受體，在應(yīng)激狀態(tài)下，NLRP3將募集ASC蛋白并作為激活pro-caspase-1的支架，無(wú)活性的pro-caspase-1將寡聚化并自動(dòng)水解切割形成具有活性形式的caspase-1，激活的caspase-1直接誘導(dǎo)IL-1β和IL-18前體的加工，促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟和釋放[19-20]。研究表明，氧化應(yīng)激釋放的ROS可激活NF-κB，NF-κB又激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-1β和IL-18分泌增多，IL-1β是一種正反饋式促炎因子，可放大炎癥反應(yīng)。由于NLRP3炎癥小體的激活可釋放大量IL-1β，IL-18和其他炎性因子，從而激活程序性的炎癥壞死，此過(guò)程稱為細(xì)胞焦亡(pyroptosis)[15，21]。然而，在應(yīng)激狀態(tài)下，針對(duì)NLRP3炎癥小體的激活對(duì)細(xì)胞命運(yùn)走向的影響，目前仍然是一個(gè)沒(méi)有明確且存在眾多爭(zhēng)論的論題。

4 Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體與自噬的關(guān)系

4.1 Keap1/Nrf2/p62與自噬的調(diào)控作用

大量研究證實(shí)，Nrf2通過(guò)Nrf2-Keap1-p62反饋環(huán)參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)[22-23]。Tang等人[6]對(duì)椎間盤(pán)退化研究中發(fā)現(xiàn)，在衰老過(guò)程中，缺乏Nrf2可加重椎間盤(pán)的退化，同時(shí)自噬相關(guān)基因 (LC3,p62,Atg5,Atg7)的表達(dá)減少。并且椎間盤(pán)退化過(guò)程中髓核細(xì)胞發(fā)生明顯氧化應(yīng)激，同時(shí)自噬水平明顯上調(diào)，而缺乏自噬的細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激毒性作用較為明顯，說(shuō)明自噬可通過(guò)Keap1/Nrf2/p62通路被激活而發(fā)揮抗氧化作用。此外，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，聽(tīng)覺(jué)細(xì)胞的死亡取決于自噬與ATP耗盡所致壞死之間的平衡，而自噬通過(guò)p62與Keap1/Nrf2相互作用而對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞壞死發(fā)揮保護(hù)作用[23]?？傊?，自噬依靠p62與Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路相互作用[24]，p62的磷酸化在選擇性自噬期間可激活Keap1-Nrf2通路而發(fā)揮相應(yīng)的作用[7]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)可激活自噬和p62介導(dǎo)的Keap1-Nrf2系統(tǒng)。自噬和Keap1/Nrf2/p62系統(tǒng)之間相互作用，對(duì)控制氧化還原穩(wěn)態(tài)和保護(hù)細(xì)胞完成適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要[25]。

4.2 NLRP3炎性小體與自噬的調(diào)控作用

研究表明，通過(guò)自噬可誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的激活，NLRP3發(fā)生磷酸化后可減少NLRP3炎性小體的激活從而減少I(mǎi)L-1β和IL-18的分泌[26]。大量ROS可激活NLRP3炎性小體而破壞腸屏障功能，同時(shí)NLRP3炎性小體的激活可誘導(dǎo)自噬，NLRP3炎癥小體的激活和自噬對(duì)腸屏障功能的破壞具有相互協(xié)同作用[27]。急性腎損傷時(shí)，線粒體可釋放大量ROS并激活NLRP3炎性小體，同時(shí)可激活自噬，該選擇性自噬可通過(guò)PINK1-parkin途徑降解受損的線粒體和減少ROS的釋放來(lái)抑制NLRP3炎性小體的激活，從而對(duì)腎具有保護(hù)作用[28]。此外，錳可使小鼠海馬和BV2細(xì)胞自噬功能障礙而激活NLRP3炎性小體，使大量促炎因子IL-1β和IL-18在體內(nèi)聚集引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)而損害海馬神經(jīng)細(xì)胞，從而導(dǎo)致海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶障礙，這可能與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[29]?？傊琋LRP3炎性小體和自噬之間具有密切聯(lián)系。NLRP3炎性小體可激活自噬，自噬也可激活NLRP3炎性小體，兩者之間的調(diào)節(jié)具有雙重[8]和雙向作用[8，30]。

4.3 Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體與自噬之間的相互作用

Nrf2系統(tǒng)和NLRP3炎性小體之間可相互作用，Nrf2系統(tǒng)可調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體下游基因的表達(dá)，而NLRP3炎性小體的激活又可調(diào)節(jié)Nrf2系統(tǒng)，兩者的相互作用與許多急性和慢性炎癥，氧化應(yīng)激以及自噬有關(guān)[31-32]。急性腎損傷過(guò)程中，機(jī)體Nrf2/ARE/HO-1通路的抗氧化防御體系明顯減弱，大量ROS聚集可激活NLRP3炎性小體，從而使腎損傷[15]和腎毒性[33]更加明顯。而腦缺血再灌注損傷后，機(jī)體可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)抑制ROS誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的激活，從而對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用[34]。上述研究說(shuō)明機(jī)體存在危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，Nrf2系統(tǒng)與NLRP3炎性小體之間可相互調(diào)節(jié)。然而Nrf2體系和NLRP3炎癥小體對(duì)自噬的調(diào)節(jié)存在復(fù)雜的關(guān)系，激活Nrf2誘導(dǎo)的自噬可激活NLRP3炎癥小體，但在某些情況下，自噬的激活可抑制NLRP3炎癥小體的活化，同時(shí)也說(shuō)明自噬對(duì)機(jī)體的調(diào)控具有雙重作用。研究表明，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可通過(guò)p62/SQSTM1依賴的方式激活自噬，通過(guò)自噬清除線粒體ROS和pro-IL1β，從而減少I(mǎi)L-1β和IL-18的產(chǎn)生。同時(shí)雷帕霉素上調(diào)p62/SQSTM1激活Nrf2通路，更進(jìn)一步清除mtROS，使IL-1β明顯減少[35]。此外，Nrf2激動(dòng)劑蘿卜硫素可激活Nrf2通路而抑制NLRP3炎癥小體，從而對(duì)糖尿病患者視網(wǎng)膜病變起保護(hù)作用?？傊?，上述研究均表明，Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體與自噬之間相輔相成，在炎癥和損傷性疾病中相互調(diào)節(jié)，相互作用。

5 藥物的開(kāi)發(fā)和治療

Nrf2通路和NLRP3炎性小體以及自噬均參與了許多病理生理過(guò)程，和許多疾病的發(fā)展及治療緊密相關(guān)。針對(duì)關(guān)鍵蛋白和重要信號(hào)通路設(shè)計(jì)和尋找藥物，可達(dá)到治療疾病的目的。研究表明，菊苣酸[15]和阿魏酸[33]可通過(guò)激活Nrf2/ARE/HO-1通路抑制NF-κB /NLRP3炎性小體來(lái)預(yù)防甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腎毒性。短鏈脂肪酸可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體和自噬對(duì)腸屏障功能障礙具有治療作用[27]。冬凌草甲素可通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和Nrf2非依賴性NLRP3炎性小體/ NF-κB通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用[36]。蘿卜硫素可通過(guò)激活Nrf2和抑制NLRP3炎性小體對(duì)糖尿病患者視網(wǎng)膜病變具有治療作用[37]。

6 小結(jié)與展望

自噬在NLRP3炎性小體激活和炎性因子分泌調(diào)節(jié)方面具有重要的作用，但作用是復(fù)雜的。此外，自噬在Nrf2系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞死亡和存活等方面中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小體通路對(duì)自噬均具有雙向調(diào)節(jié)作用，因此揭示上述兩個(gè)通路對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制及其作用將有助于于人們開(kāi)發(fā)和治療與自噬相關(guān)疾病的藥物和策略，可為藥物的發(fā)現(xiàn)和臨床治療提供新思路。