藥用植物miRNA的研究進展△

張萌，孫芮，張楠，趙巖松

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 102488

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種由內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，由約22個核苷酸組成。miRNA在動植物以及一些病毒中普遍存在。miRNA作為一種導(dǎo)向分子，通過堿基配對與靶mRNA結(jié)合，抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后的剪切或翻譯，影響蛋白質(zhì)的表達，從而調(diào)節(jié)機體的生理功能[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA在細胞分化、凋亡、增殖及腫瘤形成等不同調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要作用[2-4]。近年來，有關(guān)動物體miRNA，尤其是人體miRNA在疾病中的作用成為生命科學(xué)研究的焦點。

已有研究發(fā)現(xiàn)，外源的植物miRNA在人體內(nèi)可穩(wěn)定存在[5]，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥中的miRNA具有一定的藥理活性[6]。近年來，中藥中所包含的植物miRNA成為新的研究關(guān)注點，本文對中藥miRNA的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 中藥中存在大量miRNA

自Lee等[7]首次在秀麗隱桿線蟲突變體中發(fā)現(xiàn)miRNA以來，人們對這種長度為19～24 nt的非編碼單鏈RNA進行了越來越多的研究。近年來成為各個學(xué)科研究的熱點內(nèi)容，從生命科學(xué)到臨床醫(yī)學(xué)，從植物培育再到食品安全等，miRNA廣泛存在于自然界的動植物中。以動植物為主要來源的中藥，其中也存在大量miRNA。近10年來，關(guān)于中藥miRNA的研究飛速發(fā)展，韋春香等[8]利用高通量測序及生物信息技術(shù)預(yù)測到黃芪中所含的miRNA及其靶基因，并驗證得到miR2118和miR166可能參與了黃芪的干旱脅迫應(yīng)答；周懷香[9]利用高通量測序技術(shù)在不同品種天麻的箭麻與禾麻的花、莖、芽與塊莖4個組織中測得大量天麻miRNA；向靜等[10]也在甘草水煎劑中發(fā)現(xiàn)了豐富的甘草miRNA；馬月等[11]在地黃中測得大量miRNA；同時，人參、丹參、桑葉等中藥的miRNA也在研究中被發(fā)現(xiàn)[12-14]。

隨著研究的不斷推進，這些在中藥中發(fā)現(xiàn)的miRNA與中藥藥效是否有關(guān)？miRNA廣泛參與調(diào)控生物體的機能，那么植物miRNA是否能跨物種進入人和動物體內(nèi)，調(diào)控人和動物的生理機能？其在人與動物的生理病理過程中又發(fā)揮什么作用呢？這些問題都值得深入研究與探討。

2 中藥miRNA可跨界進入機體

植物miRNA通常經(jīng)過了甲基化修飾，較為穩(wěn)定，不易降解[15]。植物miRNA的結(jié)構(gòu)與人體miRNA的結(jié)構(gòu)非常相似，但不完全相同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，外源性的植物miRNA可以通過消化系統(tǒng)或血液系統(tǒng)進入動物體內(nèi)，調(diào)節(jié)組織和細胞的功能[16]。

早在2011年，Zhang等[17]就發(fā)現(xiàn)了植物miRNA可跨界調(diào)控動物的基因表達，他們采用solexa測序法檢測了人血漿中的miRNA，發(fā)現(xiàn)約有30～50條外源性的植物miRNA，其中miRNA-156a和miRNA-168a的豐度較高。隨后以玉米和大米等食物中廣泛存在的植物miRNA-168a為研究焦點，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-168a可通過腸道吸收并穩(wěn)定存在于哺乳動物的不同組織與器官中。隨著研究的進一步推進，研究者發(fā)現(xiàn)，miRNA-168a可以通過與肝臟中相應(yīng)靶基因mRNA低密度脂蛋白受體蛋白1(low-density lipoprotein receptor adapter protein 1，LDLRAP1)的外顯子相互作用抑制其蛋白的翻譯，從而影響血脂代謝，此研究開辟了植物miRNA跨界調(diào)控動物基因表達研究的新方向。此后，多項研究也證明，外源性的植物miRNA在動物血液和組織中可被檢測到，并具有生物學(xué)功能[18-22]。

同樣的跨界現(xiàn)象在中藥研究中得以發(fā)現(xiàn)，這種跨界現(xiàn)象參與中藥藥效的發(fā)揮。王宇亮等[23]通過Northern印記雜交法驗證丹參、生地黃水煎劑中miRNA的存在，并可經(jīng)通過口服經(jīng)消化道進入人體血液中；Zhou等[24]在2015年發(fā)現(xiàn)，中藥金銀花中的miRNA2911能在水煎液中穩(wěn)定存在，并能夠被人體吸收；隨后Huang等[25]分別從10種中藥水煎劑(半枝蓮、柴胡、穿心蓮、紫花地丁、黃芩、金銀花、連翹、蒲公英、夏枯草、魚腥草)中提取出miRNA，同時提取了人服用中藥水煎劑后的血細胞和灌胃中藥水煎劑的小鼠肺組織中的miRNA序列，進行大量生物信息學(xué)分析，計算發(fā)現(xiàn)其中有大量中藥來源的miRNA。同時Du等[26]在紅景天熬制的湯汁中提取鑒定了100多種脂質(zhì)，其中大部分脂質(zhì)也存在于中藥蒲公英、穿心蓮和金銀花中，選取其中2種磷脂酰膽堿，使之與中藥miRNA形成脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體可促進紅景天等miRNA進入人肺和胃腸道細胞。并且在體內(nèi)外實驗證明了從中藥煎煮液中提取的具有熱穩(wěn)定性的成分療效更好[27]，實驗結(jié)果揭示了中藥來源的miRNA通過脂質(zhì)復(fù)合物進入人體的可能途徑。諸多中藥miRNA的研究結(jié)果也證明，中藥miRNA也是中藥的活性成分之一，其不同以往對中藥的研究及其進入人體調(diào)節(jié)其他分子作用機制的研究，中藥miRNA可以直接調(diào)控人體靶基因mRNA的表達，這為中藥的現(xiàn)代研究提供了新的方向。

3 中藥miRNA對機體的作用

3.1 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝

最早對中藥miRNA進行研究的Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，存在于大米中的miR-168a可以從飲食中獲取進入動物體內(nèi)，并且在很多動物的血清和組織內(nèi)均可檢測到。同時發(fā)現(xiàn)，大米中存在的植物miR-168a可以與小鼠和人的脂蛋白中密度低的受體蛋白(即接頭蛋白)的mRNA 結(jié)合，抑制肝臟中靶基因mRNA的表達，降低血漿中低密度脂蛋白的清除率，從而影響膽固醇的代謝。

3.2 調(diào)節(jié)免疫功能

邵紅偉等[6]采用通用植物miRNA快速提取試劑盒提取甘草水煎劑中的miRNA，所得miRNA經(jīng)DNaseⅠ處理后進行電泳鑒定；分別利用甘草水提物、甘草酸、甘草次酸和甘草miRNA處理體外培養(yǎng)的健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，24 h后，發(fā)現(xiàn)從甘草水煎劑中確實能夠提取到miRNA，進一步印證了miRNA的穩(wěn)定性。對體外培養(yǎng)PBMC作用結(jié)果表明，與空白對照組比較，經(jīng)甘草miRNA刺激的PBMC發(fā)生了明顯的抱團，細胞數(shù)量顯著增多。隨后，向靜等[10]將從甘草水煎劑中提出的miRNA與合成的甘草miRNA模擬物作用于PBMC，進一步證明甘草的miRNA具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，隨后通過RT-PCR對其模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)基因及一部分轉(zhuǎn)錄因子、信號分子和細胞因子的基因表達變化進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草的miRNA對人免疫細胞的基因表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠明顯抑制T細胞分化相關(guān)基因以及炎癥和凋亡相關(guān)基因的表達。

3.3 抗病毒作用

2015年，Zhou等[24]在金銀花的miRNA中發(fā)現(xiàn)了具有直接針對廣譜的甲型流感病毒的miRNA2911。miRNA2911在金銀花煎劑中高度穩(wěn)定，連續(xù)飲用或灌胃給予金銀花煎劑導(dǎo)致小鼠外周血和肺中miRNA2911水平顯著升高。生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告基因測定顯示，miRNA2911可以靶向各種甲型流感病毒，包括甲型H1N1流感病毒、甲型H5N1流感病毒和甲型H7N9流感病毒。

3.4 抗炎癥作用

周懷香[9]發(fā)現(xiàn)，天麻中Gas-miR01和Gas-miR02能夠通過胃腸道進入小鼠體內(nèi)，同時發(fā)現(xiàn)，Gas-miR01和Gas-miR02可以靶向核因子激活的B細胞κ-輕鏈增強(NF-κB)信號通路上的3個關(guān)鍵炎癥相關(guān)基因A20、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)，表明天麻特有的2個miRNA分子可能是重要的植物miRNA，可以跨物種調(diào)控NF-κB信號通路上的相關(guān)基因，從而參與動物的免疫和炎癥反應(yīng)等重要生理過程。

Li等[27]在蒲公英的水煎劑中提取了一種由脂質(zhì)、miRNA等組成的外泌體樣納米顆粒，命名為湯劑體。蒲公英湯劑體與蒲公英湯劑都降低了人非小細胞肺癌(A549)細胞中聚肌胞苷酸誘導(dǎo)的促炎因子生成。同時，由脂質(zhì)和蒲公英miRNA等組成的湯劑體抗炎作用比蒲公英湯劑更強。

3.5 抗纖維化作用

Du等[26]從紅景天的根部提取miRNA進行研究。首先，對紅景天miRNA灌胃小鼠的肺組織進行高通量測序，人工合成在小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的豐度最高的8條紅景天來源miRNA序列，并在細胞模型上進行抗肺纖維化功能篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HJT-s RNA-m7是其中抗纖維化功能最顯著的miRNA。后續(xù)研究表明，HJT-s RNA-m7可以直接靶向肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin)及Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)，并在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中被證明具有較好的療效。

3.6 調(diào)節(jié)腸道菌群

徐鵬程[28]對不同組小鼠在灌胃甘草水煎劑、灌胃甘草miRNA156和尾端注射甘草miRNA156后，取小鼠新鮮糞便提取基因組DNA進行測序分析，其中甘草miRNA減少了擬桿菌門，增多了變形菌門，證明甘草miRNA156對小鼠腸道菌群和腸道組織免疫系統(tǒng)均發(fā)揮著顯著調(diào)節(jié)作用。

3.7 其他作用

Zhang等[29]在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥冬蟲夏草中的miRNA及其靶基因的表達作用與冬蟲夏草的功效完全相同。該研究組采用高通量測序和生物信息學(xué)方法對冬蟲夏草中保守的miRNA和新型miRNA進行鑒定。共鑒定出40個保守的miRNA，預(yù)測出31個新的miRNA和23個前體miRNA候選基因編碼。此外，還預(yù)測了其在人體內(nèi)的潛在靶基因，并對這些基因進行分析。生物信息學(xué)分析表明，保守型和新型miRNA的靶基因參與了發(fā)育、代謝和免疫的過程，起到抗腫瘤、降血壓、刺激免疫系統(tǒng)的作用，為冬蟲夏草的功效研究奠定了基礎(chǔ)。

4 中藥miRNA的研究意義

4.1 有利于進一步闡明中藥作用機制

中藥miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的中藥活性物質(zhì)之一，不同于以往研究中中藥有效成分的作用機制。中藥來源的miRNA可以直接調(diào)節(jié)動物靶基因的表達，因此，對中藥miRNA跨界調(diào)控作用的研究將極大推動中藥作用機制的研究，最終形成中藥miRNA-mRNA-蛋白質(zhì)-疾病治療的路線圖。

4.2 為發(fā)展現(xiàn)代中醫(yī)藥理論提供切入點

隨著現(xiàn)代科學(xué)研究方法不斷改進，研究領(lǐng)域不斷擴展，中醫(yī)藥理論也不斷豐富其內(nèi)涵。miRNA的發(fā)現(xiàn)更為現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展提供了新的方向。中醫(yī)歸經(jīng)理論是中醫(yī)理論的重要組成部分，其是指中藥作用的選擇性和中藥作用的方向性，即中藥對人體不同部位的選擇性作用。也就是說，某一種藥歸某一經(jīng)脈，意味著中藥有選擇地對其所屬的某一臟腑或經(jīng)脈的功能影響較大，但對其他臟腑或經(jīng)脈的功能影響很小或沒有影響[30]。那么中藥成分是如何在分子層面對疾病發(fā)揮作用的？不同中藥進入人體后的靶點分布是怎樣的？這種分布與中藥的歸經(jīng)理論及對傳統(tǒng)中藥作用的認識有怎樣的關(guān)聯(lián)？這些問題都值得深入探索。中藥miRNA為中藥理論研究提供一種新穎的方法，也為揭開中藥藥理作用的微觀本質(zhì)，探索中藥歸經(jīng)理論實質(zhì)提供了新的研究思路和方法。

4.3 為中藥核酸制劑的開發(fā)提供依據(jù)

miRNA技術(shù)不僅可以研究發(fā)病機制和藥物作用機制，還可以作為核酸制劑研究新的藥物。越來越多的研究表明，miRNA的模擬物或拮抗劑可以通過上調(diào)或下調(diào)機體中一些miRNA表達從而調(diào)控靶基因，以此來調(diào)節(jié)細胞功能，干預(yù)疾病發(fā)展[31-32]。隨著RNA技術(shù)的進步及世界范圍內(nèi)第一個RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 藥物的誕生，加快我國中藥miRNA開發(fā)創(chuàng)新的研究勢在必行[33]。中藥屬天然藥物，不良反應(yīng)發(fā)生率低，具有較好的人體相容性，中藥miRNA作為口服基因靶向治療劑具有巨大潛力。同時，miRNA技術(shù)也是中藥基因組學(xué)的重要組成部分，為深入挖掘中藥的潛在功效提供有效的研究思路與技術(shù)手段。

5 問題與展望

中藥是中華民族的瑰寶之一，但目前對于中藥的研究，主要集中在次級代謝產(chǎn)物的研究上，例如黃酮、皂苷等。對初級代謝產(chǎn)物的活性研究，例如核酸、蛋白質(zhì)等尚未引起廣大研究者重視。隨著miRNA作為中藥活性物質(zhì)可跨界調(diào)控機體功能被陸續(xù)證實，中藥miRNA技術(shù)為中藥活性成分及其對機體作用機制的研究提供了新的研究思路與方法。相信隨著中藥miRNA探究的繼續(xù)深入，更廣泛的中藥藥理作用會進一步被揭示出來，未來中醫(yī)藥將更受世界矚目。