CAF的分泌組學在免疫聯(lián)合療法中的應(yīng)用①

張夢琰 石 然 何敬東

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，淮安 223300)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是一個復雜的組織環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和各種類型的基質(zhì)細胞，如巨噬細胞、炎性細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)和間充質(zhì)干細胞[1-4]。CAF作為腫瘤微環(huán)境中最豐富的細胞群，在癌癥行為中發(fā)揮著重要作用[5-7]。從起源和生物學功能來看，CAF是一群具有細胞異質(zhì)性的群體，主要來源于腫瘤所駐留或募集的間充質(zhì)細胞。它們靠近癌細胞和其他基質(zhì)成分周圍，如免疫細胞、血管[8]。一般狀態(tài)下成纖維細胞主要是靜止的，僅在組織重塑和修復期間獲得短暫的活性。一旦其被激活，它們要么凋亡，要么恢復到休眠狀態(tài);否則，會出現(xiàn)組織纖維化和慢性炎癥等病理現(xiàn)象。這種慢性的組織修復反應(yīng)與癌癥的發(fā)展有關(guān)[9]。

1 CAF的來源與功能

1.1CAF的生物標記物 由于CAFs的來源復雜，常需要聯(lián)合使用多種生物學標記物對其進行鑒定。其中，α-SMA和FAP是兩種最常用的CAF標記物,但這兩個標記物并不能精準地劃分CAF亞群[10]。因此，后來有許多逐漸被證實的其他標記物，如波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast-specific protein-1,FSP1)和血小板源生長因子(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFRβ)等[11]。因此，CAFs形成了一些表達多種分子標記的異質(zhì)性細胞亞群，但這些標記不一定是成纖維細胞所特有的。

1.2CAF的生物學功能 CAF在調(diào)節(jié)腫瘤細胞行為中起著重要作用，它通過誘導癌細胞的干細胞樣特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)參與腫瘤的發(fā)生，幫助癌細胞逃避免疫監(jiān)視，在腫瘤進展和治療耐藥性中發(fā)揮著重要作用[12-14]。幾項轉(zhuǎn)錄組學和免疫組織化學的研究表明，成纖維基質(zhì)成分與患者預后不良有關(guān)，可以用于預測治療的反應(yīng)及療效[15-18]。最近的一些報道表明，CAFs通過分泌CXCL12信號和募集骨髓來源抑制性細胞來調(diào)節(jié)腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)[19,20]。在體外模型中，通過熒光素酶定量分析發(fā)現(xiàn)實驗組Colon26-luc+NIH/3T3(小鼠成纖維細胞系)的熒光信號比對照組Colon26-luc+強(P<0.05)，且實驗組CD8+TILs數(shù)量遠遠低于對照組。結(jié)果表明，CAFs通過調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)組織TILs，加速腫瘤免疫抑制，促進腫瘤的進展[21,22]。

2 CAF的分泌組學

CAFs可以分泌各種細胞因子以及降解ECM的蛋白，靶向到腫瘤部位，從而對腫瘤微環(huán)境的形成和腫瘤的進展起著重要的調(diào)節(jié)作用[23,24]。所有的微環(huán)境成分中特別是CAF，通過分泌細胞因子，如MMP9、TGFβ、CXCL12、IL-6等，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[25-28]。它們的作用包括在癌細胞周圍形成結(jié)構(gòu)基質(zhì)，有利于各種腫瘤異質(zhì)性的形成，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并刺激可降解鄰近組織的蛋白酶的產(chǎn)生，從而促進腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。

2.1生長因子 CAFs可以分泌表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等，它們介導細胞增殖、抗凋亡活性、細胞骨架重排和細胞侵襲[30-32]。

2.1.1成纖維細胞生長因子 腫瘤相關(guān)成纖維細胞分泌FGFs，如FGF-1和FGF-3，可促進腫瘤發(fā)生[33]。從人結(jié)腸癌組織分離出的CAFs與NFs培養(yǎng)上清中，發(fā)現(xiàn)FGF-1和FGF-3的mRNA和蛋白水平升高，而其他生長因子，如FGF-2和FGF-7沒有明顯差別。FGFR4是FGF-1和FGF-3的受體，隨著FGF-1和FGF-3分泌水平增高，導致了FGFR4的磷酸化。FGFR4激活后，隨后啟動下游信號通路蛋白絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MEK)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)，調(diào)節(jié)金屬蛋白酶(MMP-7)的表達，并伴有過度血管生成和細胞增殖，促進結(jié)直腸癌細胞的生長。這些觀察表明，CAF加速了結(jié)直腸癌的發(fā)生。抑制FGF信號具有抗增殖和抗血管生成的作用，可能為結(jié)腸癌的治療提供一種有用的策略[34]。然而，由于現(xiàn)有研究規(guī)模往往較小且結(jié)果相互矛盾，F(xiàn)GF-2過表達在實體腫瘤中的預后價值仍然存在爭議。基于FGF-2研究現(xiàn)狀，將18項不同研究中2 975例實體瘤患者的生存數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)評估[35]。分析表明FGF-2表達與各種實體腫瘤的不良預后相關(guān)，F(xiàn)GF-2是一種有價值的預后指標。推測FGFR2可能是一個新的治療靶點。

2.1.2血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor A,PDGF-A) PDGF能促進各種類型細胞的生長和存活，促進間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)的增殖。PDGF亞型是不同類型間充質(zhì)細胞的重要有絲分裂原，這些亞型刺激細胞的增殖、存活和分化[36]。PDGF-BB是一種約30 kD的二聚體蛋白，屬于血管內(nèi)皮生長因子家族。它可以激活PDGF-A和PDGF-B受體，誘導多種生物學功能。PDGF-BB可保護多種類型細胞不發(fā)生凋亡，促進細胞周期進程和增殖[37,38]。膽管癌是一種影響膽道的高度惡性腫瘤，其特征是有豐富的基質(zhì)，包括CAF，能促進早期轉(zhuǎn)移擴散。膽管癌衍生的PDGF-D刺激成纖維細胞分泌血管生長因子。因此，靶向成纖維細胞或PDGF-D誘導信號可能是阻斷腫瘤相關(guān)淋巴管生成和降低膽管癌侵襲性的有效工具。PDGF-D通過促進癌細胞的增殖和侵襲性、成纖維細胞的募集和活化以及異常的細胞外基質(zhì)沉積，在促進腫瘤生長方面發(fā)揮著多種作用[39]。

2.1.3肝細胞生長因子 HGF是一種主要來源于CAFs的細胞因子，參與了許多實體腫瘤細胞的表型調(diào)控[40,41]。在腫瘤行為中，HGF與腫瘤細胞上的 c-Met(一種HGF酪氨酸激酶受體)形成信號通路，介導了腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成[42,43]。在大量癌癥患者的CAFs樣本中，EGFR TKI耐藥組患者的HGF表達水平明顯高于對照組，CAFs分泌的HGF可以誘導EGFR TKI耐藥。此外，EGFR抑制劑和HGF受體抑制劑的聯(lián)合治療可能對分泌大量HGF并伴有EGFR突變的患者有改善作用[44]。另外，HGF靶向治療可能是治療其他腫瘤的一種途徑。已有研究表明，抗HGF在肺腺癌亞群中具有臨床應(yīng)用價值[45]。在相關(guān)研究中，病理標本和原位肝轉(zhuǎn)移模型表明，過表達CD44與結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)轉(zhuǎn)移有關(guān)。CRC來源的成纖維細胞(colorectal cancer-cancer-associated fibroblasts，CC-CAFs)通過上調(diào)CD44增加了CRC的黏附和遷移，促進肝或肺轉(zhuǎn)移。與正常成纖維細胞相比，CAFs分泌的HGF增加了10倍。HGF通過HGF/c-MET信號通路上調(diào)CD44，介導癌細胞與內(nèi)皮細胞黏附，進而導致CRC轉(zhuǎn)移增強。HGF可作為一種新的治療或預防靶點。

2.2趨化因子 趨化因子是指能夠吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量(多為8～10 kD)蛋白質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，如白介素家族IL-1α、IL-1β、IL-6等。IL-6是一種炎癥細胞因子，IL-6蛋白和其mRNA被發(fā)現(xiàn)在患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和結(jié)腸癌的人類和小鼠的血清中上調(diào)，在TME中通過JAK/STAT、MEK、AKT等信號通路參與腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、血管生成和腫瘤免疫抑制等過程[46]。從臨床樣本和小鼠樣本發(fā)現(xiàn)，CAFs是IL-6的主要來源。在體內(nèi)模型中，通過調(diào)節(jié)IL-6的表達水平，顯著增加了腫瘤的生長。進一步對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞浸潤減少,但MDSC加快分化，表明高水平IL-6在腫瘤微環(huán)境中破壞T細胞功能，從而引起免疫抑制現(xiàn)象。IL-6和PD-L1聯(lián)合阻斷可在HCC小鼠模型中發(fā)揮作用，延長生存期。在臨床試驗中，PD-L1免疫檢查點表現(xiàn)出一定的耐藥性。然而，在肝癌和胰腺癌模型中，當聯(lián)合IL-6阻斷時，抗PD-L1的耐藥性完全逆轉(zhuǎn)[47,48]。IL-33是IL-1家族的細胞因子，不僅在內(nèi)皮細胞、上皮細胞中表達，在成纖維細胞也有表達[49,50]。在肺癌、胃癌和肝癌患者中均檢測到血清IL-33水平升高。CAFs分泌IL-33后，通過激活EMT，參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[51]。

2.3蛋白酶類 在過去的幾十年里，CAF的研究取得了一定的進展。CAF分泌了一系列蛋白，如MMP2、MMP9、尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator,uPA)，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和免疫抑制TME中發(fā)揮著重要作用。其中，uPA是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要指標，它由CAFs分泌。靶向uPA的藥物正在進行臨床前研究，但對于臨床應(yīng)用還需要廣泛的研究。

2.3.1基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP) MMPs是一個由24個人類鋅結(jié)合內(nèi)肽酶組成的家族，它可以降解幾乎所有的ECM成分，釋放和激活許多細胞功能調(diào)節(jié)劑，成為癌癥進展和侵襲等不同階段的中心調(diào)控因子[52]。CAF通過分泌MMP，如MMP2、MMP3、MMP9等，促進ECM的侵襲并滲入血液和淋巴管系統(tǒng)[53]。越來越多的體外研究、小鼠模型和人類臨床研究表明，MMPs在腫瘤生長、血管生成和轉(zhuǎn)移等癌癥進展的所有階段中都具有一定意義。目前已知，不同的MMP在癌癥進展的不同階段可能具有相反的作用，或產(chǎn)生不同的效果[54，55]。因此，一些MMPs被認為是“藥物靶點”，而另一些則被認為是癌癥治療的“反向靶點”[56]。

2.3.2殼多糖酶3樣蛋白1 (Chitinase-3-like protein 1,Chi3L1) Chi3L1在人類中也被稱為YKL-40，約40 kD大小，是一種高度進化保守的分泌蛋白[57]。含有保守的幾丁質(zhì)酶樣結(jié)構(gòu)域，但缺乏幾丁質(zhì)水解酶活性，由多種細胞表達。Chi3L1在多種疾病中都有上調(diào)現(xiàn)象，包括慢性炎癥、纖維性疾病和各種癌癥[58]。研究發(fā)現(xiàn)，人源及鼠源的CAF上清中，Chi3L1均高度上調(diào)。在體內(nèi)模型中，對CAF中Chi3L1的基因敲除，減緩了腫瘤生長及巨噬細胞的募集，增強了CD8+和CD4+T細胞對腫瘤的浸潤，促進了Th1表型[59]。CAF來源的Chi3L1介導了腫瘤中成纖維細胞和免疫細胞之間的一個新的信號軸，從而驅(qū)動免疫抑制，促腫瘤微環(huán)境生長。綜上所述，成纖維細胞來源的Chi3L1是基質(zhì)細胞復雜的相互作用中一個新的關(guān)鍵分子，促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移，并提示靶向Chi3L1可能對癌癥有治療作用，Chi3L1可能在CAFs的促腫瘤活性中發(fā)揮作用，未來可以作為預防及治療的良好標靶。

2.3.3C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族3成員(C type lectin domain family 3 member B,CLEC3B) CLEC3B是C型凝集素超家族成員，在細胞中負責編碼四聯(lián)素并存在于各種內(nèi)分泌組織、上皮細胞和間充質(zhì)細胞，包括成纖維細胞、單核細胞和中性粒細胞中。在大多數(shù)癌癥類型中，血漿CLEC3B水平一致降低，但在腫瘤組織和腫瘤間質(zhì)組織中有不同的分布模式及表達情況[60,61]。在乳腺癌中，CLEC3B主要表達在胞漿，而在其他腫瘤中，CLEC3B的表達主要或完全局限于腫瘤間質(zhì)。CRC間質(zhì)中只有CLEC3B表達較強，正常結(jié)腸黏膜中很少或沒有表達。研究進一步采用ELISA法分析了8對CRC來源的CAFs和NFs的細胞上清液，發(fā)現(xiàn)CAF上清液中CLEC3B的分泌水平明顯高于NFs對照組上清液。IHC結(jié)果顯示，CRC腫瘤間質(zhì)中CLEC3B的表達水平明顯高于鄰近正常組織。此外，通過對93個組織樣本的臨床病理特征的分析，表明CLEC3B水平與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)(P=0.009)。皮爾森分析揭示，α-SMA(CAF的常用生物標記物)和CLEC3B之間呈正相關(guān)性，高表達α-SMA與患者低生存率相關(guān)[62]。

2.4外泌體 外泌體是由脂質(zhì)雙分子層組成的微小囊泡，并含有多種生物活性成分，包括DNA、microRNAs、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。外泌體可由多種細胞分泌，如腫瘤細胞、基質(zhì)細胞等，調(diào)節(jié)血管生成、細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[63]。腫瘤細胞分泌外泌體可以促進血管滲透性、塑造轉(zhuǎn)移微環(huán)境和介導化療耐藥，而基質(zhì)細胞也通過外泌體的分泌增強腫瘤細胞的惡性表型[64,65]。具體來說，CAFs可以通過外泌體介導細胞通訊，增加腫瘤細胞中的microRNAs，如miR-92a-3p、miR-105及功能蛋白Snail、CD81等的表達，破壞內(nèi)皮屏障，促進癌癥生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性[66-68]。靶向microRNAs或功能蛋白可能是一種新的治療策略。

3 靶向分泌因子與傳統(tǒng)免疫抑制劑聯(lián)合治療腫瘤

免疫療法，特別是免疫檢查點抑制，改變了許多癌癥的治療方案，并證實有一定的臨床效果。然而，免疫檢查點療法對許多患者并不奏效，甚至那些對治療敏感的患者會經(jīng)歷復發(fā)，為此激發(fā)了人們尋找新方法或新工具來提高傳統(tǒng)免疫療法。目前發(fā)現(xiàn)的針對CAFs分泌物靶點，如IL-6、VEGF等的治療藥物許多已進入臨床試驗。CAFs通過分泌高水平的IL-6，重塑了TME中的免疫抑制TIL群體。阻斷IL-6信號可以改善T細胞的轉(zhuǎn)運、遷移和腫瘤免疫抑制，從而改善包括食管癌在內(nèi)的多種不同類型癌癥患者的預后[69]。一些VEGF抑制劑正在進行臨床試驗，它們負責消耗內(nèi)皮細胞，而內(nèi)皮細胞是CAFs的來源之一，通過減少CAFs的數(shù)量達到治療效果[70,71]。這些分泌因子雖然處于不同的信號網(wǎng)絡(luò)，介導著不同的信號通路，但針對它們進行靶向治療均能發(fā)揮作用。聯(lián)合治療作為一種新興的治療方法，其涉及兩種或兩種以上的治療方法。聯(lián)合治療的基本原理是，不同的藥物聯(lián)合使用可以增加腫瘤的免疫原性，增強免疫治療的效果[72]。當腫瘤患者使用單一療法時，往往效果甚微，然而在聯(lián)合治療中顯示出良好的效果(如靶向分泌因子)，體現(xiàn)了聯(lián)合療法具有治療癌癥的巨大潛力[73]。如果結(jié)合不同種類的免疫制劑或其他藥物，就能克服這種反應(yīng)不足，從而增加治療的成功概率并推遲獲得性耐藥。

3.1分泌因子通過調(diào)控PD-L1靶點治療腫瘤 CAFs來源的細胞因子可能促進PD-L1的表達。之前的研究報道，CXCL5、MMP-9、IFN-γ、IL-6影響了PD-L1在癌細胞中的表達[74-77]。CAF在腫瘤環(huán)境中分泌CXCL5，進一步結(jié)合癌細胞表面的CXCR2，激活PI3K/AKT通路，促進小鼠黑色素瘤和CRC細胞中PD-L1的表達，抑制抗腫瘤免疫[78]。癌細胞和間質(zhì)細胞之間的相互作用對于腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要。因此，CXCL5在腫瘤微環(huán)境中的特性強烈支持其作為新的治療靶點的可能性。然而，它的應(yīng)用需要進一步廣泛的研究。CXCL5-CXCR2軸可能成為黑色素瘤和CRC患者的治療靶點。通過阻斷CXCL5-CXCR2可降低PD-L1的體外表達，是一種很有前景的治療方法。另外，CAF分泌的 MMP-9通過降低腫瘤表面PD-L1的表達來負調(diào)控PD-1檢查點抑制劑反應(yīng)。這種作用表明，MMP-9的藥理抑制劑可以很好地與PD-1檢查點抑制劑治療相結(jié)合。目前正在進行的一項臨床試驗正在研究一種MMP-9拮抗劑(andecaliximab,GS-5745)與一種PD-1抑制劑(nivolumab)在胃食管交界處腺癌聯(lián)合應(yīng)用。這一策略似乎特別有希望用于治療基質(zhì)豐富的癌癥，如胰腺癌[79]。

3.2分泌因子通過降低免疫抑制活性治療腫瘤 腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的主要成分在腫瘤和間質(zhì)細胞中表達，如巨噬細胞和CAF，被多次報道參與細胞的遷移、增殖、炎癥及血管生成[80,81]。在各類癌癥模型中，RAS拮抗劑可以抑制腫瘤的進展，長期使用RAS抑制劑(如ACE抑制劑、ARB)可以預防癌癥[82]。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin Ⅱ receptor blockers，ARB)作為目前最常用的高血壓一線治療藥物之一，不僅可以安全使用，且沒有嚴重的副作用，還能改變多種腫瘤間質(zhì)細胞的免疫抑制特性。ARB降低CAF中趨化因子配體12等免疫抑制因子的表達，改變了MDSC和CAF的免疫抑制特性。ARB和免疫治療聯(lián)合使用，可顯著增強CD8+T細胞依賴性的抗腫瘤作用，降低MDSC細胞產(chǎn)生VEGF的能力。顯然，免疫療法+“老藥新用”，將來可能會是一個全新的治療策略。

4 總結(jié)與展望

優(yōu)點：兩個或以上的細胞表面分子可以定義一個特定的CAF亞群，維持癌癥的干細胞特性，促進腫瘤的形成和化療耐藥。靶向CAF亞群能精準地抑制腫瘤生長，降低化學敏感性。理論上直接靶向腫瘤細胞的治療方法存在許多不足，如腫瘤之間和腫瘤組織內(nèi)部腫瘤細胞之間的異質(zhì)性，是造成療效差異的主要原因；腫瘤細胞生物學或遺傳特點的不穩(wěn)定性，在疾病進展和治療過程中極難控制；在治療過程中伴有耐藥的腫瘤細胞克隆會出現(xiàn)。而靶向于腫瘤微環(huán)境的治療策略有其自身優(yōu)勢，如腫瘤間質(zhì)細胞具有穩(wěn)定的遺傳背景，不易出現(xiàn)突變和耐藥發(fā)生；腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性更小，療效相對穩(wěn)定，并有可能預測腫瘤組織對治療的反應(yīng)性；在控制腫瘤轉(zhuǎn)移方面可以發(fā)揮極為重要的作用。

局限性：基于腫瘤類型和位置，CAF某些特定的亞群具有促進或抑制腫瘤的趨勢。但影響這些表型的機制尚未闡明。未來要將CAF應(yīng)用到癌癥治療，必須首先解決CAF復雜性，使促腫瘤發(fā)生亞型可以被抑制或回復到靜止狀態(tài)。雖然有報道稱細胞內(nèi)細胞因子表達可表征CAF亞群，但由于特異性細胞表面標記物的缺乏，極大地阻礙了CAF亞群分選和研究其功能異質(zhì)性。因此，確定CAF亞群，并針對這些亞群制定精確的抗免疫治療策略是至關(guān)重要的。

展望：近年來，隨著人們對CAF不斷深入的了解，其在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及其在免疫抑制中發(fā)揮的作用是顯而易見的，不過目前還找不到其特異性生物標記物。CAFs可以分泌多種生長因子、細胞因子和趨化因子以及降解ECM的蛋白，靶向腫瘤部位，從而對腫瘤微環(huán)境的形成和腫瘤的進展起著重要的調(diào)節(jié)作用?？紤]到免疫激活的復雜性，需要采用聯(lián)合療法，而且由于腫瘤生物學特性在不同患者和腫瘤類型之間具有相當大的差異性，需要進一步探索患者特異性的生物標志物。綜上所述，聯(lián)合治療已顯示出良好的治療前景，但仍需要進一步和持續(xù)的研究來確定安全性、有效性、最佳組合、劑量和時機。目前，IL-6阻滯劑已獲得FDA的批準，這種重塑腫瘤微環(huán)境免疫抑制的方法未來將可能是臨床上可行的策略，顯示出巨大的臨床治療優(yōu)勢。諸多研究揭示了靶向分泌因子在腫瘤免疫治療中的重要作用。其理論基礎(chǔ)建立于重塑腫瘤炎癥微環(huán)境，通過定位腫瘤細胞表面受體的分布，幫助免疫細胞對腫瘤細胞進一步的識別以及增強免疫細胞殺傷的特異性，這將為推動精準醫(yī)療做出進一步貢獻。