慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型的研究與思考?

李鵬飛，李思漢，陳揚榮，吳 競△

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院全國名老中醫(yī)藥專家陳揚榮傳承工作室，福州 350000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006)

慢性腎衰竭是慢性腎臟病后期以腎功能進(jìn)行性下降為主要特征的一種臨床綜合征[1]。因其并發(fā)癥多、預(yù)后差、醫(yī)療費用高等特點，已成為全世界迫切需要解決的健康問題之一[2]。自古以來，中醫(yī)無“慢性腎衰竭”之名，但中醫(yī)藥在慢性腎衰竭的診療中卻擁有獨特的優(yōu)勢和療效[3]。根據(jù)慢性腎衰竭的具體癥狀，屬于中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”“水腫”“癃閉”等范疇[4]。近年來，關(guān)于本病的中醫(yī)基礎(chǔ)研究也逐漸深入。

中醫(yī)證候動物模型是連接中醫(yī)基礎(chǔ)與臨床的紐帶，是探求中醫(yī)藥對疾病作用機制的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。病證結(jié)合模型同時兼具“病”與“證”的特點，其造模方法是當(dāng)前最符合中醫(yī)辨證論治特色的一種模型構(gòu)建方法，也是當(dāng)前階段中醫(yī)藥動物實驗研究最廣泛應(yīng)用的一種造模方式[6]。但目前慢性腎衰竭中醫(yī)藥研究模型仍以西醫(yī)疾病模型為主，病證結(jié)合模型鮮見，不能凸顯中醫(yī)辨證論治特色。因此構(gòu)建一種準(zhǔn)確、規(guī)范的慢性腎衰竭中醫(yī)證候動物模型，以病作為決定模型種類的依據(jù)，以證作為模型的特征，以病證結(jié)合的形式完成模型構(gòu)建，將更好地促進(jìn)慢性腎衰竭中醫(yī)科學(xué)研究的發(fā)展。

1 慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型的現(xiàn)狀分析

1.1 慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型造模方法

慢性腎衰竭病證結(jié)合模型屬于誘發(fā)性疾病動物模型,造模因素主要包括化學(xué)因素、物理因素，化學(xué)因素主要包含嘌呤霉素、阿霉素、腺嘌呤，物理因素主要包括大部腎切除、單側(cè)腎切除以及腎皮質(zhì)電灼等方式[7]。慢性腎衰竭病證結(jié)合模型造模方法大致分為4種：一是先病后證。即通過手術(shù)、藥物等多種處理方式先構(gòu)建西醫(yī)疾病或微觀病理改變的動物模型，而后通過單因素或多種因素干預(yù)形成特有的證候類型，這也是目前中醫(yī)藥動物實驗研究中最常用的造模方式[8]。如單側(cè)腎臟切除構(gòu)建慢性腎衰模型1周后，通過阿霉素干預(yù)以制備慢性腎衰竭腎陽虛證模型[9]；二是先證后病。即在經(jīng)過中醫(yī)病因干預(yù)后使動物先形成“證的模型”，再利用藥物、手術(shù)等方式構(gòu)建相應(yīng)的西醫(yī)疾病或病理模型[10]。如在電灼腎皮質(zhì)建立血瘀證基礎(chǔ)上，切除單側(cè)腎臟構(gòu)建慢性腎衰竭血瘀證模型[11]；三是病證同塑。即將“病”“證”模型的構(gòu)建手段同時作用于模式動物，以制備證候動物模型。如通過靜脈注射阿霉素同時聯(lián)合腺嘌呤灌胃干預(yù)正常大鼠模型，建立慢性腎衰竭腎陽虛證模型[12]。因該方法具有獨特的時間概念，使模型更符合中醫(yī)致病理論及證候特點，能夠較真實地模擬中醫(yī)病因致病的特征及不同時期中醫(yī)證候的動態(tài)變化[13]；四是病中有證。“病”和“證”是中西醫(yī)對于人體健康狀態(tài)的不同表達(dá)方式，疾病的發(fā)展演化伴隨著證的動態(tài)變化，因此“有病即有證”。該方法僅對動物進(jìn)行疾病模型的構(gòu)建，而后通過四診收集、以方測證等方式辨別該模型的證候[14]。如王艷等[15]觀察四逆湯對單側(cè)輸尿管結(jié)扎法制備腎纖維化模型的體征、腎功能的影響，通過以方測證認(rèn)為其符合慢性腎衰竭腎陽虛證表現(xiàn)。

1.2 慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型應(yīng)用現(xiàn)狀

就慢性腎衰竭動物模型而言，阿霉素、腺嘌呤、單側(cè)或大部腎臟切除等“疾病”造模方式已逐漸成熟，但慢性腎衰竭證動物模型的實驗運用仍寥寥無幾。目前大部分慢性腎衰竭中醫(yī)藥實驗研究仍是以慢性腎衰竭疾病模型作為參照，以致喪失了中醫(yī)辨證論治、病證結(jié)合的特色，不能真正反映中藥或中醫(yī)治法與疾病證候之間的相關(guān)性。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，僅有少數(shù)實驗[16-17]研究構(gòu)建成功慢性腎衰竭腎陽虛證、血瘀證模型，且多數(shù)以“病中有證”方法建立，科研應(yīng)用極少，復(fù)制率不高。此方法具有一定的科學(xué)性，也是當(dāng)前階段相對較為科學(xué)的慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型的制備方法。但慢性腎衰竭病因復(fù)雜，當(dāng)前階段動物辨證的標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范尚不統(tǒng)一，加之中醫(yī)的證具有相間錯雜性和動態(tài)可變性，單純的腎陽虛證或血瘀證極少見，若只是進(jìn)行一次人為辨證或只用某一簡單方劑進(jìn)行以方測證均有失偏頗。因此，對慢性腎衰竭常見證型的動物模型及致病因素方面的研究仍需積極探索。

1.3 慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型評價方法

慢性腎衰竭“病證結(jié)合”動物模型的評價體系尚待進(jìn)一步完善，較為通用的評價方式以“疾病模型評價+證候模型評價”為主[18]。

慢性腎衰竭“疾病模型”評價內(nèi)容主要包括對血肌酐、血尿素氮等指標(biāo)的檢測及對腎臟組織的病理檢查。吳燕升[19]等發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腎大部分切除處理后大鼠體內(nèi)血肌酐、尿素氮水平均明顯升高，病理檢查提示有局灶性間質(zhì)纖維化、部分腎單位皺縮等表現(xiàn)。張健等[20]通過測定5/6腎切除大鼠血清肌酐、尿素氮情況，發(fā)現(xiàn)其與人類慢性腎衰竭患者臨床表現(xiàn)相符，認(rèn)為5/6腎切除大鼠能較好地反映慢性腎衰患者各指標(biāo)變化。

慢性腎衰竭“證候模型”評價則主要包括癥狀體征評價、以方測證、客觀指標(biāo)(代謝組學(xué))評價3個方面，以方測證、望聞問切四診癥狀體征評價是最為常用的2種方式。陳紅淑等[21]發(fā)現(xiàn)，腎氣丸能顯著改善腺嘌呤干預(yù)后慢性腎衰大鼠體質(zhì)量、尿量、腎功能，因此認(rèn)為腺嘌呤慢性腎衰竭大鼠能較好地切合中醫(yī)腎陽虛證。王梓等[22]通過對腺嘌呤處理后慢性腎衰竭大鼠的四診信息采集，判定該模型能較好地模擬慢性腎衰竭中醫(yī)腎陽虛證，其癥狀主要包括攝食量減少、畏寒肢冷、蜷縮拱背、消瘦、體毛枯疏、活動減少等。

代謝組學(xué)近年來在病證結(jié)合動物模型評價領(lǐng)域運用逐漸深入，其可以揭示系列關(guān)聯(lián)生物標(biāo)記物的綜合差異，也可從整體上全面分析疾病對生物系統(tǒng)的影響[23]，具有整體性、動態(tài)性等特點。盧嫣等[24]采用代謝組學(xué)檢測方法發(fā)現(xiàn)L-2羥基谷氨酸、二腺苷五磷酸、二十六碳?；拾彼?種特異性離子可作為慢性腎衰竭肝腎陰虛證患者血清代謝客觀評價標(biāo)記物，且相關(guān)性較好。但代謝組學(xué)在慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型評價中尚未應(yīng)用。腎臟具有排泄代謝廢物、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和內(nèi)分泌等重要的生理功能[25]，慢性腎衰竭時伴隨的代謝改變更加突出。因此應(yīng)用代謝組學(xué)進(jìn)行慢性腎衰竭研究具有獨特的優(yōu)勢?；诼阅I衰患者“同病異證”代謝組學(xué)與不同造模方法的慢性腎衰大鼠代謝組學(xué)研究及相關(guān)性分析也亟待解決。

2 慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型構(gòu)建與評價思考

2.1 對慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型構(gòu)建的思考

病是對疾病全過程的縱向總結(jié)，證是對疾病過程某一狀態(tài)的橫向判斷，病與證之間并不是相互獨立的存在，因此也不能將“病證結(jié)合”動物模型的“病與證”進(jìn)行簡單的拆分，并簡單認(rèn)為是“病+證”的動物模型。疾病的發(fā)生發(fā)展必定同時伴隨中醫(yī)證的產(chǎn)生和變化，將“病”“證”分開造?？隙ú环吓R床實際。故構(gòu)建慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型亦不能將“病”“證”獨立分開，而要將二者結(jié)合起來看，“病”與“證”只是從兩個角度對患者或動物模型同一健康狀態(tài)做出的不同判定而已。

另一方面，良好的穩(wěn)定性、可復(fù)制性是慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型需要具備的特點。但綜合當(dāng)前模型構(gòu)建方式，雖造模方法多種多樣，可模型的復(fù)制成功率及認(rèn)可率均較低[26]。其原因綜合起來包括以下幾點。首先，人與動物在基因、生理病理、行為方式及生活環(huán)境等方面均存在極大的差異，因此需要明確，在實驗過程中不論何種因素誘導(dǎo)，均無法全面概括和復(fù)制出人類疾病的所有癥狀和體征，同一致病因素對于不同的動物個體也可能產(chǎn)生不同的證候表現(xiàn)。其次，造模所采用的致病因素不一定是直接引起證候發(fā)生的客觀因素，并且越多造模因素參與，病證結(jié)合模型的構(gòu)建結(jié)果會越難把握，模型可重復(fù)性也就越低。單因素造模雖然條件單一、便于控制，但模型證候不能較好地反映疾病臨床特點也是其劣勢所在[27]。

實際上，自發(fā)性疾病動物模型被認(rèn)為是與人類疾病發(fā)生發(fā)展最為相似的動物模型，不僅能夠反映疾病、證候的關(guān)聯(lián)，而且具有良好的穩(wěn)定性和可復(fù)制性[28]。應(yīng)該加強對自發(fā)性慢性腎衰竭模型動物選擇、病理表現(xiàn)、辨證分型等多方面的研究，尋找與人類慢性腎衰、證候表現(xiàn)最為相似的造模動物，規(guī)范辨證客觀化標(biāo)準(zhǔn)，并利用基因改造、基因敲除、體細(xì)胞移植等技術(shù)實現(xiàn)不同證型的慢性腎衰竭動物模型的穩(wěn)定遺傳，為慢性腎衰竭中醫(yī)藥科學(xué)化研究提供更準(zhǔn)確的實驗基礎(chǔ)。一方面可通過基因檢測等手段對不同證型患者腎組織進(jìn)行基因測序，檢測腎臟突變基因，并在動物模型上進(jìn)行人類基因改造，獲得與人類高度類似的慢性腎衰竭自發(fā)性動物模型；另一方面可考慮通過給NSG小鼠移植人的胚胎肝臟細(xì)胞來源的CD34細(xì)胞和同源胚胎胸腺組織塊,構(gòu)建具有人正常免疫功能的小鼠模型?；诖祟惸Ｐ停o予基因改造以能夠表達(dá)患者來源的相關(guān)受體，建立部分自身免疫疾病所致人源化腎衰模型。人源化動物模型目前多運用于腫瘤、自身免疫疾病的研究，其動物模型構(gòu)建技術(shù)尚處于不斷完善階段，相信高度人源化動物模型會是研究中醫(yī)證候本質(zhì)的一個新手段。

2.2 對慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型評價方式的思考

慢性腎衰竭病證結(jié)合動物模型評價方式主要包括宏觀、微觀兩方面。以方測證、動物評價量表等方法側(cè)重于從動物癥狀、體征等宏觀層面進(jìn)行模型評價，組學(xué)技術(shù)、各種理化指標(biāo)則側(cè)重于從疾病不同證型生物學(xué)標(biāo)志物方面進(jìn)行評價分析。

“以方測證”強調(diào)有是證用是方，方藥有效即推測該模型具有該方所對應(yīng)的證候。但是“以方測證”法不是“永真式”的，缺乏排他性設(shè)計，方證內(nèi)涵的不確定性是其主要缺陷。如慢性腎衰竭脾腎氣虛及脾腎陽虛證的動物模型，雖然證候不同，但健脾益氣補腎之味對二者可能均有療效，導(dǎo)致該方法對動物模型證候的評價水準(zhǔn)相對不足。因此，采用以方測證進(jìn)行動物模型證候評價時必須考慮全面，用藥合理，切合疾病證候，具備相應(yīng)的對照、排他設(shè)計(類方對照、拆方對照)。此外，不能僅僅通過疾病理化指標(biāo)作為以方測證的方式，因為疾病理化指標(biāo)并不一定具有中醫(yī)屬性，指標(biāo)的轉(zhuǎn)變并不能代表中醫(yī)證候的轉(zhuǎn)變，所以以方測證必須結(jié)合相應(yīng)的四診信息等作出綜合的證候判斷。

“動物模型評價量表”法將模式動物四診信息及體征表現(xiàn)半定量化、標(biāo)準(zhǔn)化，已能夠在一定程度上判定模式動物的證候類型，但動物與人類之間望聞問切信息具有一定差異性，大量動物四診信息尚未被挖掘，疾病與動物表征信息尚未有準(zhǔn)確客觀的聯(lián)系標(biāo)準(zhǔn)。因此，動物體征宏觀量表評價方式及其四診信息收集不全面、大量信息篩選缺乏方法學(xué)依據(jù)、評價結(jié)果主觀化等缺陷仍需要進(jìn)一步規(guī)避。對于慢性腎衰竭動物模型評價可以嘗試引入證素辨證體系，通過證候要素收集、評分，得出客觀準(zhǔn)確的證候表達(dá)。但這一想法的實現(xiàn)仍需大家多加觀察及收集，篩選與各證候具有相關(guān)性的模型動物特征表現(xiàn)，同時通過計算機數(shù)學(xué)模型、信息評價等多學(xué)科方式建立更準(zhǔn)確、可靠的慢性腎衰竭證候模型評價量表。

代謝組學(xué)技術(shù)是利用生物組織或體液的核磁共振波譜提供體內(nèi)全部小分子代謝物信息的一種方式[29]，其具有整體性、動態(tài)性、可量化性，與中醫(yī)“整體觀”“證的動態(tài)可變性”有較高的吻合度?？梢酝ㄟ^對比慢性腎衰竭不同證候類型患者之間尿液組學(xué)、血清蛋白組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)之間的差異，尋找不同證型慢性腎衰竭生物學(xué)標(biāo)志，繪制可量化的慢性腎衰中醫(yī)證候圖譜，與不同造模動物、不同造模方式對比，得出更接近人類證候的病證結(jié)合動物模型。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，必將打破中醫(yī)證候難以量化的局面，并將為慢性腎衰竭證候模型的建立及精準(zhǔn)化提供一個更佳的方式。

但不論何種評價方式，總有其優(yōu)勢與不足。從“因-脈-證-治”方面建立宏觀、微觀多種相輔相成的評價模式，將是慢性腎衰竭動物模型評價體系的發(fā)展趨勢。

3 結(jié)語

總之，慢性腎衰竭病證結(jié)合模型的建立與評價仍需不斷完善。主要包括一是疾病與證候是2種不同醫(yī)學(xué)模式下對同一疾病的不同認(rèn)識，二者并不獨立，要在動物模型上將二者結(jié)合尚需進(jìn)一步努力；二是當(dāng)前慢性腎衰竭病證模型并不能真實地反映疾病與證候的相關(guān)性及證候動態(tài)可變性，缺乏客觀化、可量化的動物模型評價方式；三是自發(fā)性疾病動物模型從動物內(nèi)部模擬疾病發(fā)病過程，使得動物模型的疾病、病理與證候穩(wěn)定、均一、可重復(fù)性高，對自發(fā)性動物模型的探究，更利于建立理想的病證結(jié)合慢性腎衰竭動物模型；四是代謝組學(xué)技術(shù)能較好地體現(xiàn)慢性腎衰竭整體觀、證候動態(tài)可變性，而直觀可見、精準(zhǔn)化的評價體系也將為慢性腎衰竭中醫(yī)證候精準(zhǔn)模型構(gòu)建及證的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供新的視角。相信將來慢性腎衰竭病證結(jié)合模型建立與評價標(biāo)準(zhǔn)的客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化，能更好地揭示慢性腎衰竭中醫(yī)“證”的本質(zhì)，促進(jìn)中醫(yī)慢性腎衰治療精準(zhǔn)化發(fā)展，使中醫(yī)藥客觀嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)研究得到進(jìn)一步發(fā)展。