牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷方法研究進(jìn)展

陸 游，南文龍，陳義平，彭大新

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。╨umpy skin desease，LSD）是一種由痘病毒科（Poxviridae）、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）、羊痘病毒屬（Capripoxvirus）的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的急性、亞急性傳染病[1-2]。LSDV 為雙鏈DNA 病毒[3]，只有1 個(gè)血清型[4]，與同為羊痘病毒屬的山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）和綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）具有共同的主要抗原[5-6]。電鏡下同屬的3種病毒在形態(tài)上無(wú)顯著差異[7]。1929年，LSD 首次在非洲的贊比亞地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，此后逐漸向北擴(kuò)散，主要在撒哈拉以南地區(qū)流行[8]。1989年后，LSD傳入部分亞歐國(guó)家。2013—2019年，LSD 擴(kuò)散至塞爾維亞、阿爾巴尼亞和俄羅斯等國(guó)家，逐步靠近我國(guó)[9-11]。2019年8月，我國(guó)在新疆伊犁地區(qū)首次確診該病。LSD 可導(dǎo)致養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失并影響國(guó)際貿(mào)易，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）動(dòng)物疫病名錄中須通報(bào)的動(dòng)物疫病[12]。依據(jù)我國(guó)動(dòng)物防疫法規(guī)定，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部暫對(duì)其按二類(lèi)動(dòng)物疫病管理并采取相應(yīng)防控措施[13]。LSD 可通過(guò)明顯的臨床癥狀診斷，其實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠分子生物學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)方法[12-15]。本文簡(jiǎn)要介紹LSD 的診斷方法研究進(jìn)展，以期為我國(guó)LSD 防控提供技術(shù)支持。

1 臨床檢查

LSD 具有特征性的臨床癥狀，包括：體溫升高達(dá)40～41 ℃，肩胛下和股前的淺層淋巴結(jié)腫大，皮膚上出現(xiàn)直徑10～50 mm 的結(jié)節(jié)，可視黏膜壞死，內(nèi)有透明漿液或膿液滲出；公牛永久或暫時(shí)不育，母牛產(chǎn)奶量大幅下降[5-6]。

實(shí)驗(yàn)條件下，LSD 的潛伏期為4～19 d。當(dāng)處于潛伏期或前驅(qū)期時(shí)，患病牛產(chǎn)生的皮膚病變需要與皮膚癬病、牛皮癬、光敏癥、放線(xiàn)菌病、放線(xiàn)桿菌病、蕁麻疹、昆蟲(chóng)叮咬、貝氏絲蟲(chóng)病、諾卡氏菌病、蠕形螨病、盤(pán)尾蚴病、盤(pán)尾絲蟲(chóng)病、蕁麻疹、皮膚結(jié)核、偽疙瘩皮膚病和牛痘鑒別[4-5，12]。此后，患病牛呈現(xiàn)黏膜壞死、破潰，需與口蹄疫、藍(lán)舌病、牛病毒性腹瀉、惡性卡他熱、牛皰疹性乳腺炎、牛傳染性鼻氣管炎和牛流行性口炎等進(jìn)行鑒別[4-5，13]。此外，LSD 還存在無(wú)臨床癥狀的隱性感染現(xiàn)象，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

分子生物學(xué)方法常用于LSDV 檢測(cè)。適合檢測(cè)的樣品有，牛精液、血清或EDTA 抗凝全血、鼻咽黏膜分泌物拭子、破潰皮膚結(jié)節(jié)內(nèi)黏液或膿液，以及研磨后的皮膚活檢組織、實(shí)質(zhì)器官組織等[15]。主要檢測(cè)方法有，常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（fluorescence quantification realtime PCR，rPCR），高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）曲線(xiàn)分析法，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增法（recombinase polymerase amplification，RPA）。

2.1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR 檢測(cè)法通?？稍诔霈F(xiàn)癥狀后的7～19 d[2]檢出樣品中的LSDV 核酸陽(yáng)性，最長(zhǎng)可達(dá)161 d。1986年，Kitching 等[16]采集了過(guò)去30年在撒哈拉以南流行的12 株羊痘病毒屬病毒，包含7 株SPPV、4 株GTPV、1 株LSDV，通過(guò)限制酶Hind III 消化后，電泳顯示3 種病毒核酸產(chǎn)生了33種不同長(zhǎng)度的條帶，其中有31 種長(zhǎng)度相似而穩(wěn)定，表明該屬病毒關(guān)系緊密。根據(jù)相關(guān)基因設(shè)計(jì)PCR引物，可實(shí)現(xiàn)LSDV 及同屬GTPV、SPPV 的通用型檢測(cè)。

Ireland 等[17]按照參考文獻(xiàn)[18]，基于附著蛋白基因VP32建立了羊痘病毒屬PCR 通用檢測(cè)方法，檢測(cè)限為10-1TCID50，檢測(cè)羊痘病毒屬的細(xì)胞培養(yǎng)和臨床皮膚活檢樣品23 份，結(jié)果均為陽(yáng)性（陽(yáng)性率100%），其中LSDV 樣品9 份、SPPV 樣品10 份、GTPV 樣品4 份。該方法具有較好的屬特異性，與牛痘病毒、羊口瘡病毒、皰疹病毒以及未感染的對(duì)照樣品均不發(fā)生反應(yīng)。

Lamien 等[19]設(shè)計(jì)了1 對(duì)跨越SPPV RPO30 蛋白基因21 bp 缺失區(qū)域的引物，檢測(cè)LSDV 和GTPV陽(yáng)性產(chǎn)物為172 bp，SPPV 陽(yáng)性產(chǎn)物為151 bp，3 種病毒檢測(cè)限均為250 copies/μL，且與羊口瘡病毒、牛丘疹性口炎病毒、豬痘病毒和鹿痘病毒樣品均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。對(duì)46 株羊痘病毒屬分離株的RPO30 位點(diǎn)進(jìn)行克隆并測(cè)序，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果與羊痘病毒屬G 蛋白偶聯(lián)趨化因子受體（GPCR）基因的繪制結(jié)果吻合。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

與常規(guī)PCR 相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)更加敏感、快速，可在病程更早期檢出低拷貝數(shù)的核酸，可應(yīng)用于羊痘病毒屬通用檢測(cè)、LSDV特異檢測(cè)以及LSDV 野毒株與疫苗株的鑒別。

Das 等[20]優(yōu)化了Bowden 等[21]和Balinsky等[22]建立的兩種羊痘病毒屬通用型rPCR 檢測(cè)方法，添加了肉牛、綿羊、山羊的β-肌動(dòng)蛋白基因（beta-actin gene，ACTB）的同源序列作對(duì)照，最低檢測(cè)限均為10 copies/μL。檢測(cè)人工感染SPPV的綿羊組織、感染GTPV 的山羊組織和感染LSDV的肉牛組織樣品共50 份，改良前后Bowden 法檢出的陽(yáng)性樣品數(shù)分別為29份（58%）和41份（82%），改良前后Balinsky 法檢出的陽(yáng)性數(shù)分別為41份（82%）和46 份（92%）。兩種方法改良后特異性均為100%，牛皰疹病毒2 型、藍(lán)舌病病毒、牛瘟病毒、小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行性口炎病毒樣品以及未感染病毒的對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

Alexander 等[23]基 于ORF044基因建立了特異性檢測(cè)LSDV 的rPCR 方法，檢測(cè)限為0.5 TCID50。運(yùn)用該方法檢出243 份血清、全血和組織樣品陽(yáng)性，與平行檢測(cè)LSDV P32 蛋白基因的rPCR 方法結(jié)果完全一致。特異性實(shí)驗(yàn)時(shí)，與SPPV、GTPV、牛痘病毒、羊口瘡病毒和小反芻獸疫病毒樣品均不發(fā)生反應(yīng)。

Eirini 等[24]基于GPCR 蛋白基因，建立了LSDV 雙探針rPCR 方法，可鑒別LSDV，并能區(qū)分野毒株和疫苗株，檢測(cè)限均為8 copies/μL。該方法較為敏感，檢測(cè)LSDV 野毒株感染組織樣品119份，結(jié)果均為陽(yáng)性（100%）；檢測(cè)LSDV 疫苗株感染組織樣品44 份，檢出陽(yáng)性43 份（98.18%）；檢測(cè)SPPV、GTPV、痘苗病毒、牛痘病毒、羊口瘡病毒和黏液瘤病毒對(duì)照樣品共73 份，結(jié)果均為陰性。

2.3 高分辨率熔解曲線(xiàn)分析

高分辨率熔解（HRM）曲線(xiàn)分析法無(wú)需設(shè)計(jì)探針，利用DNA 擴(kuò)增片段的解鏈溫度（Tm）差異，即可在單一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)突變的區(qū)分，適用于3種羊痘病毒屬病毒的鑒別。

Tesfaye 等[25]根據(jù)B22R基因同源物序列Tm平均值差異，建立了羊痘病毒屬通用HRM 方法。該方法對(duì)LSDV、SPPV 和GTPV 的檢測(cè)限分別為17.80、16.27 和17.01 copies/μL；準(zhǔn)確檢出了羊痘病毒屬病毒細(xì)胞培養(yǎng)及臨床樣品61 份，其中LSDV 樣 品32 份、SPPV 樣 品18 份、GTPV 樣 品11 份，且特異性良好，與牛皰疹病毒、小反芻獸疫病毒、羊口瘡病毒樣品均不發(fā)生反應(yīng)。

Yana 等[26]建立了區(qū)分LSDV 野毒株與疫苗株的HRM 法，檢測(cè)限均為0.1 TCID50。取不同地區(qū)同一時(shí)間感染羊痘病毒屬病毒的動(dòng)物血液和皮膚組織等樣品共32 份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，包含LSDV 野毒株11 份、LSDV 疫苗株8 份、SPPV樣品8 份、GTPV 樣品5 份。此方法特異性良好，檢測(cè)牛痘病毒和羊口瘡病毒樣品，均未見(jiàn)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種可以在恒溫（60～65 ℃）條件下進(jìn)行的基因擴(kuò)增方法，通過(guò)電泳條帶分析產(chǎn)物，根據(jù)添加特定染料產(chǎn)生的顏色變化，即可目視判斷檢測(cè)結(jié)果，適合基層實(shí)驗(yàn)室的LSD 臨場(chǎng)快速診斷。

Das 等[27]建立了VP39蛋白基因的羊痘病毒屬通用型LAMP 檢測(cè)方法，目視陽(yáng)性反應(yīng)呈天藍(lán)色，電泳驗(yàn)證陽(yáng)性產(chǎn)物為199 bp，檢測(cè)限為6.3 TCID50。檢測(cè)人工感染組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的黏膜拭子171 份、EDTA 抗凝血液78 份、組織樣品30 份，檢出陽(yáng)性拭子86 份（50.3%）、血液30 份（38.5%）、組織20 份（66.7%）；平行的rPCR 檢出陽(yáng)性拭子88 份（51.5%）、血液29 份（37.2%）、組織26份（86.7%）。與rPCR 相比，該方法總體敏感性為97.0%。特異性方面，對(duì)可能引起相似癥狀的牛瘟病毒、羊口瘡病毒、牛丘疹性口炎病毒、偽牛痘病毒樣品和未感染病毒的組織樣品，均無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增，不產(chǎn)生明顯顏色變化。

Mwanandota 等[28]基 于VP39基 因，建 立了特異性檢測(cè)LSDV 的LAMP 方法，檢測(cè)限為8 copies/μL。陽(yáng)性反應(yīng)可在紫外光下產(chǎn)生顏色變化，陽(yáng)性產(chǎn)物為192 bp。VP39-LAMP 法檢測(cè)皮膚活檢組織樣品19 份，檢出陽(yáng)性13 份（68.4%）；檢測(cè)血液樣品40 份，檢出陽(yáng)性10 份（25%）。但是同步進(jìn)行的PCR 法檢出組織陽(yáng)性7 份（36.8%）、血液陽(yáng)性?xún)H1 份（2.5%），結(jié)果存在一定差異。特異性試驗(yàn)中，該LAMP 方法與GTPV、SPPV、羊口瘡病毒的核酸均不發(fā)生反應(yīng)。

2.5 重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增法（RPA）是另一種適合臨床應(yīng)用的等溫快速擴(kuò)增方法，不需要模板的熱變性，可在較低的恒溫（45 ℃）下進(jìn)行操作。Shalaby 等[29]建立了羊痘病毒屬通用型RPA 方法，檢測(cè)臨床樣品34 份，檢出LSDV 陽(yáng)性樣品22 份、陰性樣品12 份，與rPCR 檢測(cè)結(jié)果（陽(yáng)性22 份、陰性12 份）相比，陽(yáng)性檢出率和方法敏感性均為100%，檢測(cè)限為179 copies/μL。該方法特異性良好，檢測(cè)羊口瘡病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛痘病毒、小反芻獸疫病毒以及藍(lán)舌病病毒的核酸樣品，結(jié)果均呈陰性。

3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)方法能定性、定量檢測(cè)血清抗體或感染性抗原，是LSD 實(shí)驗(yàn)室診斷的重要依據(jù)，可取牛結(jié)節(jié)或活檢樣品研磨液、破潰結(jié)節(jié)內(nèi)漿液、眼鼻分泌物、血清等進(jìn)行檢測(cè)[30]。OIE 推薦應(yīng)用病毒中和試驗(yàn)（virus neutralization test，VNT）[5]檢測(cè)LSDV 特異性血清抗體。該方法也適用于LSD 群流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)等。此外，已有商品化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒用于羊痘病毒屬的檢測(cè)，但不能進(jìn)行屬內(nèi)不同種病毒的區(qū)分。

3.1 中和試驗(yàn)

Samojlovi? 等[30]利用MDBK 細(xì)胞分離培養(yǎng)的LSDV 與接種疫苗的血清抗體開(kāi)發(fā)了LSD 的VNT 檢測(cè)方法。檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集的奶牛血清樣品200 份，結(jié)果VNT 法檢出68 份陽(yáng)性（34%），商品化ELISA 試劑盒檢出60 份陽(yáng)性（30%）；檢測(cè)血清庫(kù)中125 份陰性牛血清樣品，結(jié)果VNT 法未檢出陽(yáng)性，商品化ELISA 試劑盒檢出1 份假陽(yáng)性。

Tuppurainen 等[31]通過(guò)牛高免血清建立檢測(cè)LSDV 血清中和試驗(yàn)，檢測(cè)6 頭人工感染LSDV 的肉牛，發(fā)現(xiàn)可在接種后16～71 d 內(nèi)檢出血液樣品中的LSDV 抗原，最高血液樣品稀釋度為1:160。

3.2 ELISA 法

Bowden 等[32]基于羊痘病毒屬核心蛋白ORF095 和ORF103，建立了間接ELISA 檢測(cè)方法，用于檢測(cè)羊痘病毒屬病毒感染的血清抗體。實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)LSDV 強(qiáng)毒感染的肉牛血清、GTPV強(qiáng)毒感染的山羊血清、SSPV 強(qiáng)毒感染的綿羊血清，結(jié)果敏感性和特異性為95%～97%；而檢測(cè)相應(yīng)減毒活疫苗免疫的山羊或綿羊血清，敏感性?xún)H為30%。該方法與羊口瘡病毒樣品不發(fā)生反應(yīng)。

Carn[33]建立了檢測(cè)組織培養(yǎng)上清液和活檢組織中羊痘病毒屬抗原的捕獲ELISA 方法，最早可于LSDV 感染后7 d 檢出組織活檢樣品中的抗原，檢測(cè)限為102.8TCID50。該方法檢測(cè)不同來(lái)源的羊痘病毒屬病毒感染的組織活檢樣品10 份，結(jié)果檢出陽(yáng)性9 份，即LSDV 樣品2 份、SPPV 樣品4 份、GTPV 樣品3 份，而同步進(jìn)行的VNT 檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；檢測(cè)羊口瘡病毒、痘苗病毒、駱駝痘病毒、水牛痘病毒、藍(lán)舌病病毒樣品8 份，結(jié)果均為陰性，與VNT 檢測(cè)結(jié)果一致。

3.3 其他方法

Gamil 等[34]應(yīng)用羊痘病毒屬抗原免疫牛血清建立的間接免疫熒光抗體檢測(cè)法（indirect fluorescent antibody technique，IFAT），可用于LSD 皮膚活檢樣品的檢測(cè)，但會(huì)與羊口瘡病毒等其他痘病毒屬發(fā)生交叉反應(yīng)。

Chand[35]與Venkatesan 等[36]采用羊痘病毒感染的細(xì)胞裂解物建立的蛋白印跡試驗(yàn)（western-blot，WB）方法，可用于檢測(cè)血清中長(zhǎng)度為32 kDa 的羊痘病毒屬病毒結(jié)構(gòu)蛋白P32 的抗體。該方法的檢測(cè)靈敏性和特異性較好，但受實(shí)驗(yàn)條件限制，難以用于臨床檢測(cè)。

Kitching[37]與Sharawi 等[38]建立了瓊脂免疫擴(kuò)散法（agar gel immunodiffusion test，AGID），用放射性35S 元素標(biāo)記羊痘病毒屬特異性抗原，可檢測(cè)血清中的羊痘病毒屬病毒抗體，但與牛丘疹性口炎病毒抗體和偽牛痘病毒抗體有交叉反應(yīng)。檢測(cè)患病水牛組織樣品10 份，與平行的PCR 檢測(cè)陽(yáng)性率（100%）相比，瓊擴(kuò)陽(yáng)性率僅為70%。

Haegeman 等[39]建立了一種檢測(cè)LSDV 抗體的免疫過(guò)氧化物酶單層分析法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），可檢測(cè)最高稀釋度為1:50 的牛血清。檢測(cè)LSDV 實(shí)驗(yàn)感染的牛血清樣品116 份、LSDV 自然感染樣品28 份，結(jié)果均為抗體陽(yáng)性（100%），與VNT 和商品化ELISA 試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果一致。該方法特異性良好，對(duì)口蹄疫病毒和藍(lán)舌病病毒樣品不發(fā)生反應(yīng)。

4 結(jié)語(yǔ)

LSD 是一種新傳入我國(guó)的外來(lái)動(dòng)物疫病，有必要運(yùn)用快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。應(yīng)用常規(guī)PCR、rPCR、HRM 等分子生物學(xué)方法，可實(shí)現(xiàn)LSDV 的特異性檢測(cè)、羊痘病毒屬不同種病毒的通用檢測(cè)以及LSDV 野毒株與疫苗株的區(qū)分。目前，OIE 推薦PCR 方法用于LSD 的早期診斷、移動(dòng)群體篩查以及疫病的根除和凈化等。RPA、LAMP 等技術(shù)配合新型便攜設(shè)備開(kāi)發(fā)的臨場(chǎng)檢測(cè)方法不斷投入實(shí)踐應(yīng)用，此外數(shù)字PCR、微控流等新型分子診斷技術(shù)也將是LSDV 分子診斷的研發(fā)方向。免疫學(xué)診斷方面，OIE 推薦應(yīng)用VNT 進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、單個(gè)或群體接種疫苗后的免疫應(yīng)答評(píng)估?，F(xiàn)有的VNT、ELISA、IFAT、WB 等方法，通常用于檢測(cè)羊痘病毒屬的特異性抗體和感染性抗原，而LSDV 特異性抗體檢測(cè)方法仍有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于LSD 的診斷，可根據(jù)相關(guān)臨床特點(diǎn)，結(jié)合蟲(chóng)媒機(jī)制、發(fā)病季節(jié)等流行病學(xué)特征，選用相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行診斷。一旦發(fā)現(xiàn)疫情，果斷采取防控措施，防止擴(kuò)散，以保護(hù)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。