豬圓環(huán)病毒2 型Cap 蛋白瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，董 林，李 峰

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州 256600）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，常見基因型包括PCV1和PCV2。PCV1 無(wú)致病性，PCV2 具有致病性。PCV2 是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原，多發(fā)于5～16 周齡仔豬，死亡率達(dá)10%～30%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。PCV2 包含兩個(gè)主要的閱讀框ORF1 和ORF2：ORF1 編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep 蛋白），ORF2編碼病毒唯一的核衣殼蛋白（Cap 蛋白）。Cap 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，適用于血清學(xué)檢測(cè)[4]。由于豬群中的PCV2 混合感染、隱性感染較為普遍，因此篩選實(shí)驗(yàn)豬制備單一PCV2 血清抗體較為困難。為了解決這一問(wèn)題，本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室制備好的原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白免疫家兔，制備出兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體，建立了Cap 蛋白效價(jià)測(cè)定的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）檢測(cè)方法，為該病的臨床檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PCV2 Cap 蛋白，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并鑒定；新西蘭大耳白兔，于山東綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置；弗氏完全佐劑和不完全佐劑、聚乙二醇20000，均購(gòu)自SIGMA 公司；PCV2 Cap 蛋白IgG抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒（CSFV）IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒（PPV）IgG 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病毒（PRV）IgG 抗體PPAELISA 檢測(cè)試劑盒、兔瘟病毒（RHDV）IgG 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒，PCV2、CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV病毒抗原，PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清，瓊脂糖和瓊脂粉，梅花形打孔器（孔徑3 mm、孔距5 mm），均由山東綠都生物科技有限公司提供；0.85%生理鹽水、0.01 mol/L pH7.2 PBS，自制。

1.2 方法

1.2.1 家兔免疫 用0.01 mol/L pH7.2 的滅菌PBS，將實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)純化后的重組Cap蛋白抗原稀釋成100 μg/mL（按蛋白含量）的懸浮液，與等體積弗氏完全佐劑（CFA）混合勻漿乳化后，免疫新西蘭大耳白兔2 只，頸背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只（病毒蛋白含量為50 μg/只）。首次免疫10 d 和20 d 后，分別用1.5 倍和2 倍劑量蛋白抗原加等量弗氏不完全佐劑（IFA）勻漿乳化，背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只；加強(qiáng)免疫兩次，第3次免疫10 d 后，以與三免相同劑量抗原（100 μg/只）不加任何佐劑強(qiáng)化免疫1 次。對(duì)照組2 只新西蘭大耳白兔，每次用大腸桿菌菌液12 000 r/min 離心5 min 后的上清液，加等量滅菌0.01 mol/L pH7.2的PBS 混勻后，與試驗(yàn)組家兔同時(shí)免疫，1.0 mL/只。

1.2.2 兔抗PCV2 Cap 蛋白血清制備 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兔子于第4 次免疫后10、14、21 d，分別心臟采血20 mL，置37 ℃ 1 h 后，放4 ℃冰箱過(guò)夜；12 000 r/min 離心5 min，吸取上層血清，分裝、編號(hào)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA 法血清抗體效價(jià)測(cè)定

1.2.3.1 血清效價(jià)測(cè)定 將所有制備的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組待檢血清，分別按照1:100、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400 及1:12 800 稀釋后，按照PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書操作，檢測(cè)制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體效價(jià)。

1.2.3.2 血清ELISA 特異性試驗(yàn) 將第4 次免疫后21 d 的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清，按照1:100 稀釋后，分別應(yīng)用PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、CSFV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、PPV IgG 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒、PRRSV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測(cè)試劑盒、PRV IgG 抗體PPAELISA 檢測(cè)試劑盒、RHDV IgG 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒，測(cè)定血清抗體效價(jià)。

1.2.4 AGP 方法建立 AGP 試驗(yàn)操作步驟按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2168 號(hào)》豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗附注3 進(jìn)行。

1.2.4.1 AGP 最佳工作條件確定 采用中間孔加純化后的PCV2 Cap 蛋白抗原（100 μg/mL），周圍孔加第4 次免疫后14 d 的血清的方法，將血清抗體按照1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64 進(jìn)行倍比稀釋，分別采用不同質(zhì)量濃度（0.8%、1.0%、1.2%）瓊脂粉和瓊脂糖、不同瓊脂平板高度（3 mm、5 mm）、不同質(zhì)量濃度高滲NaCl 溶液（8%、10%）、不同溫度（25、37 ℃）以及不同觀測(cè)時(shí)間（24、48、72 h），測(cè)定血清抗體效價(jià)，以確定最佳AGP工作條件。

1.2.4.2 血清抗體最佳工作濃度確定 采用最佳AGP 工作條件，測(cè)定兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆血清抗體效價(jià)。試驗(yàn)設(shè)立PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照及制備的兔陰性血清對(duì)照。根據(jù)特異性沉淀線出現(xiàn)的明顯程度，確定該血清AGP 抗體效價(jià)及其最佳工作濃度。

1.2.4.3 AGP 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔與抗原孔之間不出現(xiàn)沉淀線時(shí)，試驗(yàn)成立。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間有明顯的沉淀線，被檢陽(yáng)性血清與抗原孔之間也形成明顯沉淀線，且與陽(yáng)性血清的沉淀線末端吻合，判為特異性沉淀線，則被檢血清判為陽(yáng)性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與抗原孔之間有明顯的沉淀線，被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，則被檢血清判為陰性。以出現(xiàn)特異性沉淀線的抗體最高稀釋倍數(shù)，作為待檢血清的AGP 抗體效價(jià)。

1.2.5 AGP 特異性試驗(yàn) 采用中間孔加制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白第4 次免疫后21d 的試驗(yàn)組和對(duì)照組血清，梅花樁周圍孔加病毒抗原的方法，對(duì)應(yīng)用聚乙二醇20000 作10 倍濃縮的CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 等病毒以及PCV2 Cap 蛋白抗原進(jìn)行AGP 試驗(yàn)，檢測(cè)待檢血清的特異性。

1.2.6 AGP 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 將第4 次免疫后14 d 的試驗(yàn)組和對(duì)照組血清，分別于血清制備后7、14、28、56 d，做重復(fù)性AGP 試驗(yàn)。采用中間孔加血清抗體、周圍孔加同一批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白（100 μg/mL）的方法，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)分別為1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。

1.2.6.2 批間重復(fù)試驗(yàn) 將制備的3 批次試驗(yàn)組血清做重復(fù)性AGP 試驗(yàn)。采用中間孔加血清抗體，周圍孔加各批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白方法，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)同批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7 AGP 符合率試驗(yàn) 應(yīng)用制備并建立的AGP方法，對(duì)20 份PCV2 Cap 蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作對(duì)照，比較檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算兩者符合率。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 法測(cè)定血清抗體效價(jià)

PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測(cè)定血清抗體效價(jià)結(jié)果見表1?？梢?，對(duì)照組血清呈現(xiàn)PCV2 抗體陰性。試驗(yàn)組第4 次免疫后14 d 及21 d采血所測(cè)的血清抗體效價(jià)可高達(dá)1:12 800，各試驗(yàn)組抗體效價(jià)均在1:6 400 以上，高于《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2168 號(hào)》規(guī)定的1:1 600 稀釋的抗體效價(jià)要求。3 批次兔免疫血清均可用于AGP試驗(yàn)。

表1 PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測(cè)定血清抗體效價(jià)結(jié)果

2.2 血清ELISA 特異性試驗(yàn)

抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA 特異性試驗(yàn)結(jié)果見表2?？梢姡詈? 次采血，即第4 次免疫后21 d 的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。

表2 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.3 AGP 最佳工作條件試驗(yàn)

以出現(xiàn)明顯沉淀線的最高稀釋度，作為判定AGP 抗體效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。表3 可見，瓊脂平板在1.0%瓊脂糖、8% NaCl、3 mm 平板高度、37 ℃下觀察72 h 為AGP 最佳工作條件。該條件下的沉淀線結(jié)果判定清晰、效價(jià)高，且節(jié)約抗原或抗體。

2.4 血清抗體AGP 效價(jià)測(cè)定

血清抗體AGP 效價(jià)測(cè)定結(jié)果見表4?？梢姡苽涞目筆CV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 效價(jià)最高達(dá)1:32，符合并高于PCV2 Cap 蛋白 AGP 抗體效價(jià)不低于1:4 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所有3 批次免疫兔血清AGP 效價(jià)均在1:16 以上，均可用于AGP 試驗(yàn)。試驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抗體效價(jià)為1:16，與制備的多克隆兔血清抗體相符，因此確定血清最佳工作濃度為血清原液。

2.5 AGP 特異性試驗(yàn)

抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 特異性試驗(yàn)結(jié)果見表5。可見最后1 次采血，即第4 次免疫后21 d 的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。

2.6 AGP 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 結(jié)果（圖1）顯示，第4次免疫后14 d，試驗(yàn)組血清制備后的7、14、28、56 d 測(cè)得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價(jià)均為1:128，且特異性沉淀線清晰，對(duì)照組血清未出現(xiàn)沉淀線，表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批內(nèi)重復(fù)性。

2.6.2 批間重復(fù)試驗(yàn) 3 批次試驗(yàn)組血清重復(fù)測(cè)3 次，測(cè)得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價(jià)均為1:128，且特異性沉淀線清晰，表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批間重復(fù)性。

2.7 符合率試驗(yàn)

20 份PCV2 Cap 蛋白樣品檢測(cè)結(jié)果見表6。用制備的抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)，分別檢測(cè)出蛋白效價(jià)為1:64 的3 份，1:128 的17 份，二者符合率為100%。

3 討論

近年來(lái)，PCV2 感染率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，深入了解PCV2 的免疫學(xué)特性，早發(fā)現(xiàn)、早治療，已成為控制該病的關(guān)鍵。由于PCV2 在PK15 細(xì)胞上增殖而不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，且目前細(xì)胞系污染嚴(yán)重，找到純凈的細(xì)胞進(jìn)行PCV2 體外培養(yǎng)十分困難，因此利用病毒特異性抗原進(jìn)行體外大量表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物適當(dāng)純化后作為檢測(cè)抗原，取代繁瑣的病毒培養(yǎng)、純化，具有重要意義[5-6]。本試驗(yàn)以PCV2 Cap蛋白為免疫原，因其抗原成分單一，大大提高了免疫效率，也避免了用全病毒作為免疫原制備抗體過(guò)程中的大量繁瑣工作和結(jié)果的不確定性。依據(jù)Cap蛋白是PCV2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能與PCV2 感染的血清產(chǎn)生特異性結(jié)合，具有中和活性的特點(diǎn)，本試驗(yàn)制備了抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體，對(duì)常見豬源病毒CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明本研究制備的多克隆抗體可用于后續(xù)PCV2 的免疫學(xué)特性研究。

表3 不同條件下血清AGP 抗體效價(jià)結(jié)果

表4 PCV2 Cap 蛋白抗體AGP 法測(cè)定血清抗體效價(jià)結(jié)果

表5 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

圖1 PCV2 Cap 蛋白AGP 效價(jià)

表6 抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清符合率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白建立的AGP 檢測(cè)方法，經(jīng)特異性、穩(wěn)定性、符合率試驗(yàn)，證明制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白血清效價(jià)高，且具有良好的特異性、穩(wěn)定性，與PCV2 豬陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，可完全替代標(biāo)準(zhǔn)抗體，用于PCV2 Cap 蛋白AGP 試驗(yàn)檢測(cè)。