犀角地黃湯合銀翹散影響PKC-SSeCKS介導(dǎo)的F-actin變構(gòu)抑制流感病毒誘導(dǎo)的PMVEC通透性增加①

劉歡葦 張 舒 鄧 迪 毛 欽 郭 銳 吳 珺 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物學(xué)系,北京 102488)

犀角地黃湯合銀翹散(Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder,XDY)源自吳鞠通《溫病條辨·上焦篇》，銀翹散清解衛(wèi)分之毒，犀角地黃湯解營(yíng)血毒，兩方相合可達(dá)清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡(luò)之效，先證用藥，截?cái)嗖?shì)。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：XDY可明顯降低病毒性肺炎模型小鼠體內(nèi)炎性因子和肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細(xì)胞總數(shù)，改善肺指數(shù)、肺病理改變，降低肺血管通透性，下調(diào)肺組織中細(xì)胞間黏附分子(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-l)和血管細(xì)胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-l)的表達(dá)[1-3]。但XDY對(duì)病毒誘導(dǎo)肺血管通透性增加的影響和機(jī)制還未闡明。

PMVEC與肺泡上皮細(xì)胞共同構(gòu)成肺泡-毛細(xì)血管屏障，F(xiàn)-actin變化會(huì)直接影響其骨架完整性并造成通透性改變[4]，在病毒性肺炎發(fā)生過程中，PKC通路被激活，其下游底物SSeCKS由在正常細(xì)胞內(nèi)散在分布轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核周和細(xì)胞皺褶處并誘導(dǎo)F-actin變構(gòu)形成絲狀應(yīng)力纖維[4，5]，導(dǎo)致PMVEC通透性增加，屏障功能下降，細(xì)胞和含蛋白的液體滲出增多，形成肺水腫[6]。

因此，本研究將觀察XDY對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的PMVEC通透性改變和對(duì)PKC-SSeCKS介導(dǎo)的F-actin變構(gòu)的影響，以探討XDY治療病毒性肺炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 根據(jù)陳瑞華等[7]的方法進(jìn)行大鼠PMVEC原代培養(yǎng)和鑒定。

1.1.2病毒 流感病毒甲型鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/34(H1N1)(FM1)，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，-70℃保存。雞胚尿囊腔中傳代兩次后，收集尿囊液。用微量血凝試驗(yàn)(HA)檢測(cè)病毒血凝效價(jià)為1∶512，病毒感染MDCK細(xì)胞24、48、72 h后，采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。流感病毒FM1的TCID50為10～4.6/0.1 L。

1.1.3藥物 犀角地黃湯合銀翹散(水牛角30 g、生地30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g、牛蒡子9 g) 購(gòu)自北京同仁堂藥店，制成水煎劑。根據(jù)張晨月等[2]的方法和劑量制備含藥血清。

1.1.4主要試劑和儀器 M199 培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；雙抗(Solarbio)；ECGS(BD);PKC活性檢測(cè)試劑盒(Promega);PKC抑制劑(Midostaurin);綿羊抗大鼠SSeCKS 抗體(Sigma)；TRITC標(biāo)記的兔抗綿羊IgG(Jackson)；FITC-鬼筆環(huán)肽(Molecular Probes)；跨膜電阻儀(Millipore MERS00002)。

1.2方法

1.2.1內(nèi)皮細(xì)胞通透性的檢測(cè) 將大鼠PMVEC(2×105cells) 接種于0.5% 明膠包被的Transwell 小室內(nèi)，上、下室分別加入0.5 ml和1.5 ml M199 完全培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)單層融合后，設(shè)置對(duì)照組、模型組(100TCID50FM1)、PKC抑制劑組(100TCID50FM1+10 μmol/L PKC抑制劑)和XDY組(100TCID50FM1+15%XDY含藥血清)。將跨膜電阻儀調(diào)至歐姆檔，將2個(gè)STX-2電極分別置于Transwell小室表面和下室內(nèi)，于24 h測(cè)量各組阻抗值，并測(cè)未接種細(xì)胞的小室阻抗值，每室重復(fù)3次。TER= (測(cè)得阻抗值-空白阻抗值)× Transwell小室的底面積，單位為Ω·cm2。TER反映溶質(zhì)離子傳遞電流的強(qiáng)弱，與細(xì)胞通透性呈反比。

1.2.2PKC活性的檢測(cè) 設(shè)置對(duì)照組、模型組、PKC 抑制劑組和XDY組。干預(yù)因素作用24 h后將各組細(xì)胞收集并勻漿，離心(4℃,14 000 r/min,5 min)取上清，按PKC活性檢測(cè)試劑盒操作說明測(cè)定上清液的PKC 活性，電泳檢測(cè)時(shí)，同一泳道條帶的灰度比值反映上清液中PKC 激酶活性。

1.2.3SSeCKS的mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè) 設(shè)置對(duì)照組、模型組和XDY組，干預(yù)因素作用24 h，收集細(xì)胞，按RNeasy Mini kit試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用TE10倍稀釋。根據(jù)GenBank 提供的SSeCKS 基因已知序列(AY695056),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDS區(qū)的上游引物序列為5′-AATCCATCCCAATCATAGTAAC-3′,下游引物序列為5′-TCTCAAGGTCCCAACAGC-3′，內(nèi)參GAPDH 的上游引物序列為5′-ATGACCCCTTCATTGACC-3′,下游引物序列為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增按One-Step SYBR PrimeScript PT-PCR KitⅡ試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。收集細(xì)胞，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用Western blot 方法檢測(cè)SSeCKS 蛋白表達(dá)量。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察SSeCKS和F-actin在細(xì)胞內(nèi)的定位和結(jié)構(gòu)的改變 將5×108cells/L 的細(xì)胞100 μl種于激光共聚焦專用96孔板內(nèi)，分組如上，干預(yù)因素作用24 h后，置于4%多聚甲醛中4℃固定1 h，以1% Triton X-100進(jìn)行膜通透10 min，PBS清洗后，加正常兔血清室溫封閉1 h，傾去。SSeCKS用抗SSeCKS抗體4℃孵育過夜，洗滌后避光，以TRITIC熒光Ⅱ抗4℃孵育1 h；F-actin用FITC-鬼筆環(huán)肽染色，洗滌，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC通透性的影響 病毒作用于PMVEC 12 h左右TER開始下降，24 h下降最明顯(圖1A)，因此本研究選取24 h作為XDY含藥血清干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。干預(yù)因素作用24 h 時(shí)，與對(duì)照組相比，模型組TER降低(P<0.01)；與模型組相比，PKC抑制劑組與XDY組TER明顯增高(P<0.01)，見圖1B。

2.2XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影響 干預(yù)因素作用24 h后，與對(duì)照組相比，模型組PKC活性增強(qiáng) (P<0.01)；與模型組相比，PKC抑制劑組和XDY組PKC活性降低(P<0.01) ，見圖2A、B。

圖1 大鼠PMVEC通透性的變化Fig.1 Change of rat TER of PMVECNote:A.Change of TER of PMVEC infected by influenza virus at different time points;B.Effect of XDY on TER of PMVEC infected by influenza virus Control;##.P<0.01,vs Model.

圖2 XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影響Fig.2 Effect of XDY on activity of PKC of PMVEC infected by influenza Note:1.Control；2.Model；3.PKC inhibitor；4.XDY.**.P<0.01,vs Control;##.P<0.01,vs Model.

2.3XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表達(dá)和定位的影響 干預(yù)因素作用24 h后，模型組SSeCKS mRNA表達(dá)比對(duì)照組明顯增多 (P<0.05)；與模型組比，XDY組SSeCKS mRNA的表達(dá)明顯降低 (P<0.05)，見圖3A。流感病毒感染大鼠PMVEC 24 h后，模型組SSeCKS蛋白表達(dá)量明顯增多；與模型組比，XDY組SSeCKS的蛋白表達(dá)明顯降低，見圖3B。激光共聚焦顯微鏡下顯示，對(duì)照組PMVEC中SSeCKS均勻分布在細(xì)胞中；而模型組SSeCKS集中分布于核周；XYD組可明顯改善模型組SSeCKS分布情況，趨于正常，見圖3C。

2.4XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin在細(xì)胞內(nèi)的定位和結(jié)構(gòu)改變的影響 對(duì)照組PMVEC中F-actin主要分布在細(xì)胞周邊和核周，微絲微管分布均勻、排列整齊,胞周可見F-actin形成的致密周圍束；與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞周邊的F-actin致密束基本消失，形成應(yīng)力纖維；與模型組相比，XDY的PMVEC在病毒作用后細(xì)胞骨架基本完整，可見F-actin分布于細(xì)胞周邊的致密周圍束，趨于正常，見圖4。

圖3 XDY對(duì)病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表達(dá)和定位的影響Fig.3 Effect of XDY on expression of SSeCKS mRNA and protein and its location in PMVEC infected by influenza virusNote:A.SSeCKS mRNA protein expression;C.SSeCKS location in PMVEC.*.P<0.05,vs Control;#.P<0.05,vs Model.

圖4 XDY對(duì)流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin分布和結(jié)構(gòu)的影響(激光共聚焦顯微鏡)Fig.4 Effect of XDY on distribution and structure of F-actin in PMVEC infected by influenza virus(Laser scanning confocal microscopy)

3 討論

病毒性肺炎發(fā)生時(shí)，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，是影響患者預(yù)后和明顯增加死亡率的危險(xiǎn)因素[8]。PMVEC通透性改變是發(fā)生ARDS的重要環(huán)節(jié)[9]，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，流感病毒感染的肺炎小鼠肺血管通透性升高，肺間質(zhì)炎性滲出增多，肺指數(shù)升高；XDY可使肺炎小鼠肺組織通透性降低，滲出減少，肺指數(shù)降低。PMVEC是構(gòu)成肺血管屏障的主要細(xì)胞，我們用原代培養(yǎng)的大鼠PMVEC為模型，采用跨膜電阻儀監(jiān)測(cè)PMVEC的TER以觀察其通透性變化，結(jié)果表明XDY可顯著抑制流感病毒誘導(dǎo)的PMVEC通透性增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染的 PMVEC中PKC活性明顯增強(qiáng)，特異性PKC抑制劑可顯著抑制PMVEC中PKC活性并顯著抑制其通透性增加，說明流感病毒誘導(dǎo)的PMVEC通透性增加依賴PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路。Src抑制蛋白激酶C的底物(SSeCK)是一種表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的支架蛋白，相對(duì)分子量為280～290 kD，在急性肺損傷中作為炎癥反應(yīng)蛋白過度表達(dá)[10]。

SSeCK是PKC的結(jié)合蛋白也是其底物，可以通過與PKC選擇性結(jié)合，破壞內(nèi)皮細(xì)胞通透性穩(wěn)定狀態(tài)[10]。體外培養(yǎng)過度表達(dá)異源性SSeCKS的成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)纖維狀肌動(dòng)蛋白、紐蛋白相關(guān)的細(xì)胞黏著斑缺失和細(xì)胞偽足樣突起的形成[5]。PKC信號(hào)通路激活后，其底物SSeCKS可誘導(dǎo)F-actin應(yīng)力纖維的形成，緊密連接、黏附連接和內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)解聚，使PMVEC通透性增加，進(jìn)而觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并放大肺部炎癥反應(yīng)[10]，誘發(fā)ARDS。F-actin是構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞骨架的主要成分，其變化直接影響PMVEC通透性。內(nèi)皮細(xì)胞受到炎性介質(zhì)刺激后，F(xiàn)-actin發(fā)生變構(gòu)：球狀肌動(dòng)蛋白聚合形成絲狀肌動(dòng)蛋白，位于細(xì)胞膜附近的致密周圍束消失,形成應(yīng)力纖維,導(dǎo)致細(xì)胞強(qiáng)烈收縮[4]，而SSeCKS由在正常細(xì)胞內(nèi)散在分布轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核周和細(xì)胞皺折處，最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞收縮，增大、增多細(xì)胞間的縫隙,使PMVEC通透性增加[5]。

本研究結(jié)果顯示，流感病毒感染PMVEC后，細(xì)胞中PKC活性增強(qiáng)，同時(shí)SSeCKS mRNA和蛋白表達(dá)增加，SSeCKS在細(xì)胞中的定位由在細(xì)胞內(nèi)散在均勻分布變?yōu)榧杏诤酥?，而?xì)胞內(nèi)F-actin在細(xì)胞周邊形成的致密周圍束消失，微絲微管排列紊亂甚至消失，說明流感病毒感染所致PMVEC通透性增加與PKC-SSeCKS通路密切相關(guān)；XDY干預(yù)可使流感病毒感染后PMVEC中PKC活性降低，SSeCKS mRNA和蛋白表達(dá)減少，同時(shí)可見SSeCK在細(xì)胞中散在均勻分布，而細(xì)胞內(nèi)F-actin在細(xì)胞周邊的致密周圍束又復(fù)出現(xiàn)，F(xiàn)-actin的變構(gòu)被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果說明，XDY可下調(diào)流感病毒激活的PKC-SSeCKS信號(hào)通路，降低SSeCKS的表達(dá)，減輕下游F-actin致密周圍束解聚的變構(gòu)現(xiàn)象，阻止細(xì)胞收縮導(dǎo)致的細(xì)胞間隙增大，從而抑制流感病毒性肺炎中流感病毒引起的PMVEC通透性增高，緩解內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，減輕炎癥。

“毒損肺絡(luò)”是現(xiàn)代醫(yī)家在衛(wèi)氣營(yíng)血傳變規(guī)律的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)和病理學(xué)提出的病因病機(jī)學(xué)說。張偉等[11]將中醫(yī)學(xué)說的毒分內(nèi)外，外毒為六淫、戾氣和環(huán)境毒邪等，致病途徑包括五官九竅和腠理經(jīng)絡(luò)等與外界接觸的部位；內(nèi)毒的致病途徑有機(jī)體代謝異常、五情失常和病理產(chǎn)物。肺絡(luò)布散于整個(gè)肺組織，分為氣絡(luò)和血絡(luò)，分別與解剖學(xué)中的氣管、支氣管和肺內(nèi)毛細(xì)血管對(duì)應(yīng)[12]。流感病毒是引起病毒性肺炎的最常見病原，屬外毒范疇，PMVEC屬肺之血絡(luò)，其通透性改變是病毒性肺炎的一個(gè)重要病理變化，也是引起ARD的主要原因[9]，因此，病毒性肺炎屬“毒損肺絡(luò)”范疇，治療病毒性肺炎應(yīng)注重解毒與通絡(luò)，銀翹散可清解衛(wèi)分毒，去除損害因素，犀角地黃湯清解營(yíng)血分毒并化瘀通絡(luò)，兩方合用療效甚佳[13]。本實(shí)驗(yàn)研究證明，XDY改善流感病毒感染所致的肺微血管通透性增加，是其清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡(luò)的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。