化瘀解毒方對胃癌上皮間質轉化作用的研究①

魏 征 張愛華 李亞峰 梁瑞峰 張俊萍

(河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004)

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，其死亡率位居所有惡性腫瘤第二位[1,2]。由于癥狀不典型，胃癌的早期診斷率低，中晚期治療效果不盡人意，就診時大多處于進展期，多已發(fā)生轉移[3,4]。遠端轉移和周圍淋巴結侵襲是胃癌患者治療效果不如意的主要原因，也嚴重制約著胃癌患者治療后的生存率提高[5，6]。研究表明，腫瘤細胞能夠通過上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT) 而獲得間質細胞表型，從而具備侵襲性，實現(xiàn)對周圍組織的浸潤，促進轉移過程[7,8]。EMT是上皮來源瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[9]。EMT的轉化和與之相關的上皮型和間質型基因表達失調和細胞信號轉導通路異常都與胃癌轉移密切相關[10]。而化瘀解毒方在臨床經過長期實踐選定的有效經驗方。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，化瘀解毒方能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[11]。化瘀解毒方能否抑制腫瘤細胞EMT的進程以及逆轉EMT的發(fā)生尚不清楚。因此，探明HYJD是如何抑制和逆轉胃癌EMT進程，從而達到抑制胃癌細胞侵襲轉移的作用分子機制，對于尋找和開發(fā)新的抗腫瘤中藥具有重要意義。本實驗研究在前期研究基礎上，將進一步對HYJD在胃癌細胞EMT動態(tài)過程的作用進行研究，闡明HYJD在胃癌發(fā)生EMT過程中以及在逆轉此過程中的作用，為開發(fā)和研究新的抗腫瘤中藥提供一定的實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1HYJD方組成及溶液制備 為了保證試驗藥效的一致性，藥物來源使用配方顆粒劑，確保指紋圖譜的一致性?；鼋舛痉脚湮闉槿? g，天龍3 g，三七粉3 g，半枝蓮15 g。將配方顆粒劑全蝎、天龍、三七粉、半枝蓮(廣東一方制藥有限公司)換算成等效生藥量配伍比例后，溶于240 ml不含血清的1640培養(yǎng)基中。用孔徑0.22 μm的無菌濾膜過濾除菌，配置成含生藥量濃度為100 mg/ml的母液待用。

1.1.2細胞 人胃癌細胞株SGC-7901和正常胃黏膜細胞株GES-1購自中國科學院上海細胞庫

1.1.3試劑及抗體 RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)； E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體(Cell Signaling公司)；胰蛋白酶、BCA定量試劑盒和MTT 粉劑(碧云天公司)；Transwell 小室(康寧公司)；β-actin 抗體(Sigma 公司)；HRP標記的羊抗兔IgG二抗和HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗(Thermo公司)；Matrigel 膠 (BD 公司)； TGF-β1(PEPROTECH 公司)。

1.1.4儀器 倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司)，SERIES 8000 WJ 型恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，Mini X25型垂直電泳儀，Universar HoodⅢ蛋白凝膠分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)，EnSpire型號全自動酶標儀(PerkinElmer公司)，蛋白質凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代 人胃癌細胞株SGC-7901細胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中(含有10% FBS的1640培養(yǎng)基)，細胞培養(yǎng)于恒溫細胞培養(yǎng)箱中(5%CO2，37℃)。觀測細胞密度達75%～85%，可進行細胞傳代及實驗，使用對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化，并重懸成單細胞懸液備用。

1.2.2藥物分組 使用之前配制好的100 mg/ml的母液，后續(xù)實驗用含有2% FBS的1640或空白培養(yǎng)基，將母液稀釋成2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml的不同濃度進行研究，空白組只加含有2% FBS的1640或空白培養(yǎng)基。

1.2.3EMT模型建立 取對數(shù)生長期的SGC-7901 細胞，消化備用，重懸成單細胞懸液，均勻地接種于6孔板中，恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜，每孔中加入含TGF-β1濃度(15 ng/ml)的1640培養(yǎng)基，在孵育箱中繼續(xù)孵育24 h。顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化和EMT相關蛋白的變化，確定造模成功。

1.2.4細胞活力檢測 取SGC-7901 和GES-1細胞，消化并重懸成單細胞懸液(5×104個/ml)，每孔100 μl，均勻種于96 孔板中。將實驗組分為HYJD組(為5、10、15、20、25、30 mg/ml)、陰性對照組 (等量的空白1640 培養(yǎng)液) 。恒溫孵育箱繼續(xù)孵育12 h，每孔分別加入100 μl含不同濃度HYJD的培養(yǎng)液，恒溫孵育箱中孵育24 h 。每孔加入5 mg/ml 的MTT 20 μl，37℃孵育4 h，輕輕移除上清，每孔加入二甲基亞砜150 μl。振蕩10 min，充分溶解結晶。全自動酶標儀檢測，以490 nm波長條件，讀取每個孔的吸光度(OD)值。抑制率=(1-藥物組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.5Western blot 取對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞種于6孔板中培養(yǎng)過夜。再分別給予不同濃度的HYJD(2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml)作用細胞24 h后，收集細胞總蛋白。移除細胞培養(yǎng)液，PBS洗2 遍，加入適量RIPA裂解液冰上裂解，離心(12 000 r/min，20 min)取上清，提取細胞總蛋白。BCA 測定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液(Loading buffer)后，進行10% 的SDS-PAGE 電泳，電泳結束，將PAGE膠中的蛋白電轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃ 孵育過夜。二抗室溫孵育2 h。將PVDF膜加上化學發(fā)光液后，利用蛋白質凝膠成像系統(tǒng)拍照并計算出結果。

1.2.6侵襲轉移能力檢測 根據(jù)侵襲和轉移不同實驗要求，將Transwell 小室底膜用Matrige膠包被(稀釋8倍)，轉移實驗不包被。將SGC-7901 細胞消化并重懸，將單細胞懸液濃度調整到5×105個/ml，加200 μl到小室的上室中，使細胞個數(shù)為104個，同時小室的下室加700 μl完全培養(yǎng)基(含10%FBS)，將小室分為陰性對照組、模型對照組、HYJD組(2.5 mg/ml，5 mg/ml，10 mg/ml)。恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。輕輕取出小室并用無菌PBS 輕輕沖洗2～3 遍，上室表面的細胞可用棉簽輕輕擦去，室溫下甲醇固定25 min，室溫風干5 min，室溫下結晶紫染液著色30 min，然后再用PBS或者蒸餾水輕輕清洗3遍，顯微鏡下計數(shù)各個小室下面膜上的細胞數(shù)，計數(shù)小室上下左右和中間5個視野，計算出平均值。

2 結果

2.1細胞形態(tài)學變化和EMT標志蛋白的檢測 細胞的生長狀態(tài)原本是聚集生長的，TGF-β1誘導后變?yōu)榱朔稚⑸L。 此外，單個細胞觀察可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導后細胞的形態(tài)變化很大，細胞形態(tài)由原來典型的上皮細胞形態(tài)(不規(guī)則四邊形)，變成了梭狀，典型的間質細胞形態(tài)，并且在細胞的邊緣伸出長長的偽足和片狀偽足如圖1所示。 Western blot檢測經典EMT相關蛋白(E-cadherin，N-cadherin和Vimentin)的水平，結果發(fā)現(xiàn)，表征細胞與細胞基質異質黏附的N-鈣黏蛋白的表達明顯增高，與此同時，表征細胞與細胞之間黏附的E-鈣黏蛋白表達明顯降低。而間質細胞標志蛋白波形蛋白表達明顯增強如圖2所示。結果表明經TGF-β1可以成功誘導人胃癌SGC-7901細胞發(fā)生EMT。

2.2HYJD對細胞增殖的影響 陰性對照組GES-1和SGC-7901 細胞生長良好，經5～30 mg/ml HYJD分別處理24 h后，10 mg/ml濃度以下的HYJD處理后， 促進了GES-1細胞的增殖， 濃度超過25 mg/ml以后對細胞具有顯著的抑制作用。經5～30 mg/ml HYJD分別處理24 h后，SGC-7901細胞的增殖明顯被抑制，并且隨著HYJD濃度的增加，抑制率不斷增強，如圖3所示。與未處理組比較，濃度大于10 mg/ml的HYJD作用細胞24 h后具有明顯的抑制作用。根據(jù)數(shù)據(jù)計算出HYJD的24 h半數(shù)抑制濃度為11.4 mg/ml。為減少藥物本身的細胞毒作用對本研究的干擾，后繼實驗選用HYJD濃度為2.5、5、10 mg/ml作用胃癌細胞24 h做進一步研究。

圖1 TGF-β1誘導前后SGC-7901細胞形態(tài)的變化(×100)Fig.1 Morphological changes of SGC-7901 cells induced by TGF-β1(×100)

2.3HYJD對EMT相關蛋白表達的影響 經不同濃度的(2.5 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml)HYJD作用人胃癌SGC-7901 細胞24 h后。Western blot結果分析表明，與TGF-β1誘導后的細胞相比較，隨著HYJD濃度的增加，E-cadherin表達明顯增高，說明胃癌細胞的上皮表型特質正在慢慢提高。而隨著HYJD濃度的增高，N-cadherin的表達和Vimentin蛋白的表達逐漸受到抑制，說明胃癌細胞的間質表型在降低(圖4)。

2.4對SGC-790細胞侵襲轉移能力的影響 實驗設置陰性對照組和模型組，藥物組分為2.5、5、10 mg/ml的HYJD，與模型組比較，經藥物處理胃癌SGC-7901 細胞24 h后，穿膜細胞數(shù)明顯減少如圖5所示。實驗結果說明HYJD能顯著抑制胃癌細胞的侵襲轉移如表1所示。

圖2 TGF-β1誘導前后SGC-7901 EMT標志物的變化Fig.2 Changes of SGC-7901 EMT markers before and after induction of TGF-β1Note:*.P<0.05 vs Negative control group.

圖3 HYJD對GES-1細胞和SGC-7901細胞的生長抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of HYJD on growth of GES-1 and SGC-7901 cellsNote:*.P<0.05 vs Control group.

圖5 HYJD對胃癌細胞侵襲轉移的影響(×100)Fig.5 Effect of HYJD on invasion and metastasis of gastric cancer cells(×100)

表1 HYJD對胃癌細胞侵襲轉移的影響

Tab.1 Effect of HYJD on invasion and metastasis of gastric cancer cells

TGF-β1(10 μg/L)HYJD(mg/ml)InvasionMigration-0108.7±8.24189.8±27.36+0145.5±12.31298.5±34.37+2.5 100.2±15.321)196.2±15.841)+5.0 79.3±11.201)124.0±20.911)+10.0 55.8±12.741)84.8±19.631)

Note：1)P<0.05 vs Model group.

3 討論

胃癌轉移是導致患者病情進展、治療失敗和死亡的主要原因[12-15]。EMT對于生物的發(fā)育具有重要的意義，EMT在生物的組織修復和分化生長中都發(fā)揮著重要作用，很多研究已經表明EMT對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移至關重要，一些EMT的生物指標甚至成為腫瘤預后的中藥指標[16]。EMT是來源于上皮的惡性腫瘤細胞獲得侵襲轉移能力的重要生物學過程，胃癌細胞通過EMT改變自身性質，獲得較強的侵襲轉移能力。TGF-β/Smad信號通路中 TGF-β與細胞膜上的TGF-βⅡ型受體(TBRⅡ)結合，與轉錄因子相互作用激活EMT相關基因的表達而介導EMT[17-19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HYJD能明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移[11]，而EMT又是侵襲轉移的重要生物學環(huán)節(jié)，因此其作用很可能與HYJD抑制EMT轉化的過程有關。而其具體作用及分子生物學機制尚不清楚。本實驗研究發(fā)現(xiàn)HYJD能顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901的生長，結果說明HYJD具有明顯的抑瘤效果。進一步研究發(fā)現(xiàn)HYJD能上調TGF-β1誘導的細胞中E-cadherin的表達，同時降低N-cadherin和 Vimentin EMT相關標識蛋白的表達。這些實驗結果說明HYJD能夠顯著抑制胃癌細胞發(fā)生EMT，甚至在EMT已經發(fā)生后成功逆轉EMT的過程，促使胃癌細胞由間質細胞向上皮細胞轉化。另據(jù)研究顯示，胃癌細胞發(fā)生EMT以后，其侵襲和轉移能力明顯增強[18,19]。腫瘤細胞的EMT過程受到抑制，會直接導致細胞的侵襲和轉移能力下降。而實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導后的胃癌細胞確實具有較強的侵襲轉移能力，而加入不同濃度的HYJD以后，胃癌細胞的侵襲轉移能力明顯降低，這說明細胞的侵襲和轉移能力受到明顯抑制。而這結果也間接證明了HYJD可以抑制和逆轉胃癌細胞EMT的發(fā)生，從而達到抑制胃癌侵襲轉移的目的。綜上所述，HYJD能顯著抑制人胃癌SGC-7901 細胞增殖，并且能夠有效抑制和逆轉人胃癌SGC-7901 EMT的過程，從而抑制胃癌細胞的侵襲轉移，但其是如何抑制和逆轉胃癌細胞EMT進程的仍不清楚，其中的分子機制還有待進一步研究。