連翹酯苷A通過p38 MAPK/NF-κB信號(hào)抑制哮喘氣道炎癥①

林 星 李俊峰 車 楠 李良昌③ 李 莉③

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科,延吉 133000)

過敏性哮喘(Allergic asthma)通常由過敏原吸入引起，是一種異質(zhì)性炎癥性疾病。哮喘主要病理特征包括嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性及后期的氣道重塑[1,2]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為慢性炎癥在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但具體機(jī)制尚不清楚。哮喘治療通常使用皮質(zhì)類固醇藥物，但常伴有一系列不良反應(yīng)，例如抑制下丘腦-垂體軸，減少骨生長(zhǎng)和增加機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，迫切需要尋求安全有效的治療哮喘的治療藥物。

連翹酯苷A(Forsythiaside A,FSA)是一種從中草藥連翹中分離出來的活性成分，具有抗炎作用[4]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)SA抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5]。然而，目前尚不清楚FSA是否對(duì)哮喘有保護(hù)作用。在這里，我們建立了OVA誘導(dǎo)的哮喘模型，觀察FSA對(duì)OVA哮喘炎癥的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為：SCXK(吉)2018-0007。將小鼠飼養(yǎng)在溫度受控的室內(nèi)，12 h光照/黑暗循環(huán)，隨意提供食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。遵循相關(guān)動(dòng)物保護(hù)法，實(shí)驗(yàn)中盡量減少動(dòng)物痛苦。

1.1.2試劑 連翹酯苷A(Forsythiaside A，F(xiàn)SA，純度>98%)購自國家藥品和生物制品控制研究所(北京)。OVA、氫氧化鋁凝膠購自美國Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。小鼠IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的ELISA試劑盒購自R&D Systems(Minneapolis，MN)。IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、p-p38 MAPK、p38 MAPK、NF-κB p65和β-actin抗體均購自Santa Cruz公司(Santa Cruz，CA，USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1OVA哮喘小鼠模型建立 40只小鼠隨機(jī)分為5組：正常組(CON)，哮喘模型組(OVA)，F(xiàn)SA低劑量組(FSA 15)，高劑量組(FSA 30)和地塞米松組(DEX)。在第1天和第14天通過腹腔注射2% OVA和氫氧化鋁的PBS混合液200 μl致敏，CON組小鼠注射相同體積的PBS。在第21至23天，以1% PBS OVA溶液15 ml霧化激發(fā)30 min。每次OVA激發(fā)前，F(xiàn)SA 15組和FSA 30組分別按15和30 mg/kg，DEX組按照10 mg/kg劑量進(jìn)行灌胃。

1.2.2BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 參照文獻(xiàn)方法[6]，最后一次OVA激發(fā)后24 h處死小鼠，1 ml的PBS氣管灌洗后收集BALF，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清液用于細(xì)胞因子檢測(cè)。將細(xì)胞沉淀涂片后Diff-Quik染色，高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。取小鼠左肺上葉10%甲醛固定，石蠟包埋。右肺剪碎后放入液氮中速凍，保存于-80℃冰箱，待用。

1.2.3BALF中細(xì)胞因子測(cè)定 根據(jù)生產(chǎn)商的說明，采用ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ的含量。

1.2.4小鼠肺切片組織學(xué)染色 石蠟包埋的肺組織切片后，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，進(jìn)行HE、PAS和Masson染色后，每只小鼠隨機(jī)選3張切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 切片60℃熔蠟，檸檬酸鹽修復(fù)抗原，3% H2O2孵育10 min，血清封閉后p-p38 MAPK和NF-κB p65抗體4℃過夜，第2天，二抗孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。

1.2.6Western blot免疫蛋白印跡 參照文獻(xiàn)方法[7]，蛋白提取后BCA方法測(cè)定蛋白濃度。12%膠分離蛋白質(zhì)樣品，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉后，IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65和β-actin一抗(1∶1 000稀釋)4℃過夜。第2天，TBST洗滌膜3次，并與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。ECL發(fā)光后美國GE AI600凝膠成像儀進(jìn)行攝像分析。

2 結(jié)果

2.1FSA對(duì)哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞的影響 計(jì)數(shù)各組小鼠BALF炎癥細(xì)胞總數(shù)(Total cells)后進(jìn)行Diff-Quik染色(如圖1所示)。對(duì)BALF中炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)(如表1所示)，結(jié)果顯示，OVA組小鼠炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于CON小鼠，然而，F(xiàn)SA及地塞米松處理可顯著抑制各炎癥細(xì)胞及炎癥細(xì)胞總數(shù)的增加(P<0.05)。

2.2FSA對(duì)哮喘小鼠BALF中Th1/Th2因子的影響 與CON組小鼠比較，OVA組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量顯著升高，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，經(jīng)過FSA及地塞米松處理后，IL-4、IL-5、IL-13含量降低而IFN-γ含量顯著升高，與OVA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 小鼠BALF中細(xì)胞Diff-quik染色(×200,箭頭所示為嗜酸性粒細(xì)胞)Fig.1 Diff-quik staining of cells in BALF of mice(×200,the arrow shows eosinophils)

2.3FSA對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 HE染色結(jié)果顯示，CON組小鼠氣道壁及其周圍軟組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞浸潤。OVA激發(fā)小鼠可見氣道壁增厚，黏膜水腫，小血管及細(xì)支氣管周圍炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，部分黏膜上皮可見損傷及脫落。而FSA及地塞米松處理后，小血管及細(xì)支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，氣道平滑肌增生不明顯，氣道結(jié)構(gòu)較為完整。PAS染色顯示OVA組中PAS陽性細(xì)胞顯著增多，但可被FSA及地塞米松抑制。Masson染色顯示OVA組小鼠氣道下膠原沉積較CON組小鼠明顯增多，而FSA處理可對(duì)這種膠原沉積發(fā)揮抑制作用，如圖2所示。

2.4FSA對(duì)哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明，與CON組小鼠比較，OVA組小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)增多，IFN-γ表達(dá)減少(P<0.05)，經(jīng)過FSA及地塞米松處理后，OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)升高，與OVA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖3所示，與ELISA結(jié)果相符。

2.5FSA對(duì)p38 MAPK磷酸化及NF-κB活化的影響 如圖4A所示，免疫組化結(jié)果顯示，OVA組小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65陽性細(xì)胞較CON組小鼠增加，而在不同劑量FSA組及地塞米松組中陽性細(xì)胞數(shù)較OVA組明顯減少。同時(shí)Western blot結(jié)果表明，與CON組比較，OVA組小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65水平明顯升高，而不同劑量FSA及地塞米松處理后，其含量降低，與OVA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖4B、C所示。

GroupsTotal cellEOSNEULYMCON2.32±0.230.07±0.040.11±0.080.48±0.12OVA7.65±0.551)5.23±0.361)0.39±0.101)1.42±0.361)FSA 156.36±0.582)4.34±0.422)0.32±0.092)1.36±0.122)FSA 304.26±0.312)3.36±0.222)0.18±0.082)0.98±0.152)DEX3.19±0.252)0.98±0.182)0.14±0.062)0.75±0.172)

Note：Vs CON group,1)P<0.05;vs OVA group,2)P<0.05.

GroupsIL-4IL-5IL-13IFN-γCON78.65±7.49 70.45±7.4939.46±7.3273.21±4.59OVA292.48±12.691)456.41±18.291)89.62±6.321)23.49±2.391)FSA 15251.24±10.412)421.28±17.212)76.36±7.362)46.47±3.282)FSA 30174.69±9.122) 275.69±14.982)65.78±6.252)52.38±4.512)DEX126.27±8.912) 149.78±10.262)43.52±5.162)69.47±5.842)

Note：Vs CON group,1)P<0.05;vs OVA group,2)P<0.05.

圖2 FSA對(duì)小鼠肺組織病理改變的影響(×200)Fig.2 Effect of FSA on pathological changes of lung tissue(×200)

圖3 FSA對(duì)小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ表達(dá)的影響Fig.3 Effect of FSA on expression of IL-4，IL-5，IL-13 and IFN-γ in lung tissue of miceNote:Vs CON group，#.P<0.05;vs OVA group，*.P<0.05.

圖4 FSA對(duì)OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of FSA on expression of p-p38 MAPK and NF-κB p65Note:A.Immunocytochemistry staining for p-p38 MAPK and NF-κB p65 in lung tissue(×200);B.Western blot of p-p38 MAPK in lung tissue.C.Western blot of NF-κB p65 in lung tissue.Vs CON group,#.P<0.05 ;vs OVA group,*.P<0.05.

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，其病理特征包括炎癥細(xì)胞廣泛浸潤、杯狀細(xì)胞增生并過量分泌黏液、氣道下膠原沉積等。在哮喘的發(fā)病過程中，炎癥細(xì)胞顯著增多并廣泛浸潤到氣道周圍是哮喘最主要的特征，其中，浸潤細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞為主，也包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等[8]。本實(shí)驗(yàn)中HE染色結(jié)果表明，F(xiàn)SA有效改善了OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞的浸潤。此外，對(duì)各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SA顯著減少了哮喘小鼠模型BALF中各炎癥細(xì)胞及總炎癥細(xì)胞數(shù)量的增加。氣道上皮中杯狀細(xì)胞增生并分泌過量黏液也是哮喘的重要特征，本實(shí)驗(yàn)的PAS染色結(jié)果表明，F(xiàn)SA可有效緩解OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道上皮中杯狀細(xì)胞的增生，并可抑制氣道黏液的過量分泌。此外，Masson染色結(jié)果表明，F(xiàn)SA可抑制氣道下膠原沉積。因此，F(xiàn)SA可有效改善OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠模型的氣道炎癥反應(yīng)。

在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中，除了炎癥細(xì)胞的參與，細(xì)胞因子也發(fā)揮著重要作用。IL-4、IL-5和IL-13主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，Th2細(xì)胞的分化與聚集是哮喘炎癥反應(yīng)加重的重要原因，而Th1細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ等，據(jù)研究表明，提高Th1反應(yīng)可抑制哮喘的發(fā)展[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了各組小鼠BALF和肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ水平。結(jié)果表明，F(xiàn)SA處理可顯著減少哮喘小鼠BALF及肺組織中IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ水平，因此，F(xiàn)SA可通過降低Th2細(xì)胞因子，提升Th1細(xì)胞因子而糾正OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠Th1/Th2失衡。

為了探究FSA緩解哮喘炎癥的可能機(jī)制，我們研究了p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路。p38 MAPK是MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)家族的成員之一，在受到刺激時(shí)發(fā)生磷酸化而激活，從而參與多種生物學(xué)效應(yīng)，如調(diào)控炎癥反應(yīng)等[10]。本次實(shí)驗(yàn)中免疫組化及Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)SA可以減少哮喘小鼠肺組織中p38 MAPK磷酸化水平。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，與包括哮喘等多種炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。通常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκBα結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到相關(guān)因子刺激時(shí)，IκBα發(fā)生磷酸化并被降解，而將NF-κB活化、分解為p50和p65并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與調(diào)控基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[11]。目前已有大量研究表明，支氣管哮喘的氣道炎癥反應(yīng)與NF-κB活化密切相關(guān)。本次研究中，通過免疫組化及Western blot發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SA可顯著降低NF-κB p65表達(dá)水平并阻礙其入核。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在受到刺激時(shí)可發(fā)生磷酸化，磷酸化的p38 MAPK可使有絲分裂原和應(yīng)激活化蛋白激酶1(MSK1)發(fā)生磷酸化，繼而激活NF-κB[12]。活化的NF-κB可調(diào)控多種炎癥分子表達(dá)，如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等，調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞因子水平，發(fā)揮其炎癥調(diào)控作用[13]。

綜上所述，F(xiàn)SA可以顯著改善OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠模型氣道炎癥細(xì)胞的浸潤，抑制氣道上皮中杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌，減少氣道下膠原沉積，同時(shí)，F(xiàn)SA可通過影響IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ等細(xì)胞因子水平而糾正哮喘小鼠模型的Th1/Th2失衡，并且其機(jī)制可能與p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。