山莨菪堿對心肌缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激、心肌損傷及線粒體凋亡通路的影響①

宋艷玲 麥華德 林蕓蕓 陳明慧 王雅純 顧申紅

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，海口 570000)

心肌缺血再灌注損傷是麻醉手術(shù)治療過程中常見的一種病理變化，如體外循環(huán)下的心臟手術(shù)，心肌梗死患者進(jìn)行的溶栓治療等，都是引起心肌缺血再灌注損傷的重要原因[1]。缺血期引起的心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、氧化應(yīng)激、心肌損傷及線粒體凋亡等一系列損傷性變化，嚴(yán)重的會因心律失常而導(dǎo)致猝死[2，3]。山莨菪堿(Anisodamine,Anis)是一種源于茄科植物唐古特山莨菪根的生物堿，這種生物堿在缺血再灌注損傷中具有心肌保護(hù)功能，能夠減少心肌梗死面積，改善微循環(huán)、防止再灌注心律失常及無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生[4,5]。有研究表明，Anis通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)，緩解心肌缺血再灌注損傷[6]，但具體機(jī)制尚不明確。本文旨在研究Anis對心肌缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激、心肌損傷及線粒體凋亡通路的影響，以期了解Anis對心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的作用機(jī)理，從而為心肌缺血提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級SD大鼠45只，體重200～300 g；購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，粵監(jiān)證字 2004A029號，大鼠分9個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只。所有大鼠均飼養(yǎng)在本院動物學(xué)部屏障環(huán)境獨(dú)立通氣籠，溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.1.1藥物與試劑 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；肌紅蛋白(Myohemoglobin,Mb)試劑盒、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB,CK-MB)試劑盒購自上?；鈱崢I(yè)有限公司；IL-6免疫組化試劑盒購自美國貝克曼庫爾特有限公司；誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)試劑盒購自安徽大千生物；Caspase-3抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司；蘇木素、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；Bak、Bcl2、Apaf1抗體購自南京建成生物工程研究所；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司。

1.1.2儀器 BS-124s型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；DW-T6彩色多普勒超聲儀購自江蘇大為醫(yī)療有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型 將45只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)選9只為健康組(Control)，其余36只大鼠分別分為：模型組(I/R)、低劑量山莨菪堿組(Anis 1 mg/kg)、中劑量山莨菪堿組(Anis 2 mg/kg)和高劑量山莨菪堿組(Anis 4 mg/kg)，采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立缺血再灌注模型，制作方法及判斷模型是否成功參考李言明等[7]研究。具體操作如下：腹腔注射戊巴比妥鈉溶液 50 mg/kg麻醉，切開左胸第2～5肋之間的皮膚，分離皮下組織及前鋸肌和胸大肌后切開第2～3肋間肌暴露心臟，結(jié)扎使得心肌細(xì)胞缺血，缺血時間為15 min后灌注10 min，1 h后再次缺血15 min后灌注10 min，消毒，縫合。

1.2.2藥物干預(yù) 低劑量山莨菪堿組大鼠于缺血再灌注術(shù)前靜脈注射Anis 1 mg/kg，第一次缺血再灌注后再次靜脈注射Anis 1 mg/kg；中劑量山莨菪堿組大鼠于缺血再灌注術(shù)前靜脈注射Anis 2 mg/kg，再灌注后靜脈注射Anis 2 mg/kg；高劑量山莨菪堿組大鼠于缺血再灌注術(shù)前靜脈注射Anis 4 mg/kg，再灌注后靜脈注射Anis 4 mg/kg；模型組和健康組大鼠靜脈注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3檢測項目

1.2.3.1HE染色觀察 使用HE染色，具體步驟為：將大鼠處死后取大鼠心肌組織，使用二甲苯浸泡后使用酒精梯度脫水，再用蘇木精浸泡，鹽酸酒精分化，最后使用氨水沖洗一次，再次重復(fù)酒精沖洗過程，完成后使用伊紅染色30 s后使用95%酒精浸泡1～2 min后再次使用100%酒精10～15 min，分別使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡10～15 min最后中性樹膠封片即可。使用10×40倍鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.3.2心臟功能的檢測 采用DW-T6彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠平均動脈壓(Mean artery pressure，MAP)、左室收縮壓水平(Left ventricular systolic pressure，LVSP)。

1.2.3.3氧化應(yīng)激物質(zhì)及心肌損傷標(biāo)志水平檢測 從頸總動脈插管接取1 ml 大鼠血液，嚴(yán)格按照MDA、SOD、CK-MB、Mb試劑盒子上的操作方法，檢測其含量水平。

1.2.3.4炎癥因子水平檢測 從頸總動脈插管接取1 ml 大鼠血液，嚴(yán)格按照IL-6、iNOS ELISA試劑盒上的操作方法，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清中的各成分含量水平。

1.2.3.5Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3.6免疫組化檢測 本實驗中免疫組化采用PV 法染色，將石蠟切片 5 μm，常規(guī)脫蠟后使用3%過氧化氫甲醇液室溫浸泡 15 min并使用 4%胃蛋白酶消化15 min，滴加一抗 Caspase-3(效價1∶50)，置于濕盒中恒溫冰箱保存12 h，使用0.01 mol/L PBS清洗后滴加二抗葡聚糖-酶復(fù)合物，37℃孵育60 min，再次使用0.01 mol/L PBS清洗，顯色后使用蘇木素復(fù)染1 min 脫水并封片，使用10×40的倍鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS22.0，作圖軟件采用GraphPad Prism5，方差分析使用單因素方差分析，當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義時，采用SNK方法進(jìn)行進(jìn)一步的比較；使用單因素方差分析時，若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠心肌細(xì)胞HE染色觀察及心臟功能檢測結(jié)果 由圖1A可以看出，健康組大鼠心肌組織正常，肌外膜完整，心肌纖維完整，肌纖維縱切面可見周期性橫紋(明暗相間帶)，肌紅蛋白溶解，肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；低劑量山莨菪堿組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲；中劑量山莨菪堿組大鼠心肌組織少量正常肌肉組織，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)，肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細(xì)胞核大小形態(tài)未見異常，肌纖維縱切面可見周期性橫紋(明暗相間帶)；高劑量山莨菪堿組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲。由圖1B可以看出，相比健康組，模型組大鼠LVSP、MAP水平顯著降低(P<0.05)，相比模型組，山莨菪堿處理各組LVSP、MAP水平顯著升高(P<0.05)，且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。

2.2大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及心損標(biāo)記物檢測結(jié)果 由圖2可以看出，相比健康組，模型組大鼠MDA、CK-MB、Mb水平顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組山莨菪堿處理各組MDA、CK-MB、Mb水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.05)且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。

2.3大鼠炎癥因子檢測結(jié)果 由圖3可以看出，相比健康組，模型組大鼠IL-6、iNOS水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組山莨菪堿處理各組大鼠IL-6、iNOS水平顯著降低(P<0.05)，且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。

2.4凋亡相關(guān)蛋白免疫組化觀察及水平檢測結(jié)果

圖1 大鼠心肌細(xì)胞HE染色觀察及心臟功能檢測結(jié)果Fig.1 Rat myocardial cells observed by HE staining and test results of cardiac functionNote:A.HE staining of rat cardiomyocytes(×400);B.The result of cardiac function test in rats;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

圖2 大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及心損標(biāo)記物檢測結(jié)果Fig.2 Results of oxidative stress response and heart damage markers in ratsNote:A，B.The markers of oxidative stress in rats;C，D.The results of rat heart loss markers;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

圖3 大鼠炎癥因子檢測結(jié)果Fig.3 Test results of inflammatory factors in ratsNote:A.The result of IL-6 test;B.The result of iNOS test;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins was detectedNote:A.The immunohistochemical observation of Caspase-3(×400);B.The relative level of Caspase-3 protein imprinting;compared with healthy group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05.

由圖4A可以看出，相比健康組，模型組大鼠Caspase-3陽性細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)；相比模型組大鼠，山莨菪堿處理各組大鼠Caspase-3陽性細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。由圖4B可以看出，相比健康組，模型組大鼠Caspase-3水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組山莨菪堿處理各組大鼠Caspase-3水平顯著降低(P<0.05)，且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。

2.5線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果 由圖5可以看出，相比健康組，模型組大鼠Bak、Bcl2、Apaf1水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組大鼠，山莨菪堿處理各組大鼠Bak、Bcl2、Apaf1水平顯著降低(P<0.05)，且隨著使用山莨菪堿處理劑量增加呈劑量依賴性。

圖5 線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig.5 Test results of mitochondrial apoptosis pathway-related proteinsNote:A.The Bak protein level test result;B.The Bcl2 protein level test result;C.The Apaf1 protein level test result;compared with the healthy group，*.P<0.05;compared with the model group #.P<0.05.

3 討論

LVSP是心臟向動脈射血的主要動力，在心臟舒張時內(nèi)壓降低，腔靜脈血壓回流入心臟，心臟每收縮和舒張一次構(gòu)成一個心動周期[8]。MAP為一個心動周期中動脈血壓的平均值稱為平均動脈壓[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用山莨菪堿處理各組大鼠，心肌細(xì)胞肌纖維斷裂溶解彎曲和凋亡細(xì)胞顯著減少，且LVSP、MAP水平顯著升高，說明山莨菪堿可以有效保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷同時有效改善心臟功能。邢坤[10]研究表明：山莨菪堿可以緩解缺血再灌注損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

隨著生活和醫(yī)療的需要活性氧族的研究越來越成熟，在健康的細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但是在氧化應(yīng)激情況下，會產(chǎn)生大量的ROS，對細(xì)胞膜造成損傷，同時還會導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜通透性增加，使得細(xì)胞內(nèi)的SOD、GPX等酶釋放至細(xì)胞外[11]。MAD的含量可以反映機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解，由此可以得知MAD的含量可間接反映出細(xì)胞損傷的程度[12]。血清中IL-6、iNOS的水平與心肌炎癥呈正相關(guān)，心肌細(xì)胞炎癥越嚴(yán)重IL-6、iNOS水平越高，同時心肌細(xì)胞損傷的程度越高[13]。從本實驗中可以看出，使用山莨菪堿處理的各組MDA水平降低、SOD水平升高，說明大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激被抑制。IL-6、iNOS水平顯著降低，說明山莨菪堿可以緩解心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低缺血再灌注后的損傷。張杰等[14]研究表明：山莨菪堿可以通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)缺血再灌注損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種程序性死亡，其中Caspase是細(xì)胞凋亡的核心。Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的凋亡因子[15]，在Caspase家族中主要執(zhí)行凋亡的基因為Caspase-3[16]。研究表明：在線粒體中存在Cyt-c蛋白，在細(xì)胞凋亡時線粒體會促進(jìn)這種蛋白的釋放，Cyt-c蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中會與細(xì)胞質(zhì)Apaf1相互作用，導(dǎo)致Caspase-9活化，有活性的 Caspase-9裂解使得 proCaspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3，并通過剪切另外的 Caspase 底物引起級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)控制腫瘤細(xì)胞的凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)使用山莨菪堿處理各組Apaf1蛋白水平顯著降低，說明山莨菪堿抑制了線粒體釋放Cyt-c和Apaf1進(jìn)入細(xì)胞漿，有效抑制了由線粒體介導(dǎo)的信號途徑啟動的細(xì)胞凋亡，同時心肌細(xì)胞內(nèi)Caspase-3陽性率及蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明山莨菪堿可以通過抑制Caspase-3的表達(dá)，阻止心肌細(xì)胞缺血后的程序性死亡，實現(xiàn)保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。孟曉燕[18]研究表明：山莨菪堿可以抑制Caspase-3的表達(dá)活化，與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子較多，不僅有 Caspase 家族，Bcl2家族也是一種常見的凋亡控制基因[19]。Bcl2家族中主要包括：Bcl2、Bax和Bak。Bax和Bcl2表達(dá)呈相反趨勢，當(dāng)Bcl2表達(dá)下降時 Bax和Bak表達(dá)上升，此時會促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；當(dāng)Bcl2表達(dá)升高，而 Bax和Bak表達(dá)降低時，則會抑制細(xì)胞的凋亡[20]。其中Bak可以誘導(dǎo)線粒體碎裂和細(xì)胞色素C釋放，并刺激Bax的表達(dá)，兩者協(xié)同細(xì)胞的凋亡[21]。本實驗中發(fā)現(xiàn)使用山莨菪堿處理后Bak水平顯著降低，說明山莨菪堿可以通過降低Bcl2家族的細(xì)胞凋亡因子實現(xiàn)緩解大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注后的損傷。容俊芳等[22]研究表明：山莨菪堿可以下調(diào)Bax，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，山莨菪堿可以通過降低氧化應(yīng)激、抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及線粒體凋亡通路實現(xiàn)緩解心肌缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)阻止體內(nèi)過氧化損傷，其作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)阻止體內(nèi)過氧化損傷相關(guān)。但本研究涉及到的Anis劑量較少，在后續(xù)的實驗中將使用更多濃度梯度的Anis作用于心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的大鼠，探討不同Anis濃度對心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用效果。