無血預(yù)充大鼠外周靜脈-動(dòng)脈體外膜氧合模型建立的初步探索

蔡黎明，張巧妮，李勇男，黃永胡，吉冰洋

體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）是體外循環(huán)技術(shù)在臨床使用上的延伸和擴(kuò)展，其本質(zhì)是一種人工心肺機(jī)，通過部分替代心臟和肺臟的功能以減輕患者本身心肺壓力從而獲得恢復(fù)時(shí)機(jī)的原理來達(dá)到治療目的。相關(guān)臨床數(shù)據(jù)顯示，ECMO的使用從最初患者并無明顯受益且并發(fā)癥發(fā)生率高到現(xiàn)在的臨床治療效果顯著，ECMO技術(shù)的使用在臨床上發(fā)揮著重要作用［1］。但是相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制及干預(yù)措施仍有待進(jìn)一步研究，因此一個(gè)成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型的建立對(duì)ECMO技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用十分重要。

對(duì)于ECMO的機(jī)制探討及研究已經(jīng)成為時(shí)下熱點(diǎn)問題，相關(guān)大動(dòng)物模型的建立和研究也備受關(guān)注［2-3］。但是傳統(tǒng)的大動(dòng)物模型人力、物力成本大，不適宜開展大樣本的研究，而大鼠價(jià)格低廉，具有與人類相似的心血管系統(tǒng)及大量豐富的基礎(chǔ)研究技術(shù)手段。本課題組在傳統(tǒng)體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)等大鼠模型的建立上經(jīng)驗(yàn)豐富［4-9］，因此，本研究在對(duì)已有的體外生命支持動(dòng)物模型學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良，建立了大鼠外周靜脈-動(dòng)脈（veno-artery，V-A）ECMO模型，同時(shí)就建立過程中的關(guān)鍵問題展開討論。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2014-5-30-GZR）。選取成年健康雄性SD大鼠5只，體重350～500 g（由本院動(dòng)物中心提供）。

1.2 麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備 隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)大鼠，于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。稱重后4%～6%七氟烷誘導(dǎo)麻醉10～15 min后，四肢固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)。使用16 G特殊用靜脈留置針（Becton Dickinson公司）經(jīng)口氣管插管，隨后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行機(jī)械通氣（60%氧氣與40%氮?dú)獾幕旌蠚怏w作為氣源），2%～3%七氟烷維持麻醉，呼吸頻率設(shè)定為70～80次／min，潮氣量6～8 ml／kg，呼吸機(jī)參數(shù)根據(jù)動(dòng)脈血?dú)饨Y(jié)果進(jìn)行調(diào)整。監(jiān)護(hù)儀溫度探頭經(jīng)石蠟油潤滑后置入肛門3～5 cm實(shí)時(shí)監(jiān)測體溫。

1.3 外科準(zhǔn)備 手術(shù)部位備皮、消毒，精細(xì)游離雙側(cè)股動(dòng)脈并穿刺置管。雙側(cè)股動(dòng)脈使用22 G一次性使用靜脈留置針（蘇州林華醫(yī)療器械股份有限公司），并經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈通路給予500 U／kg肝素抗凝，連接監(jiān)護(hù)儀（PHILIPS）進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測；右側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管成功后連接ECMO動(dòng)脈灌注端；精細(xì)游離右側(cè)頸靜脈并外科切開置管送入自置靜脈引流管，尖端至下腔靜脈入右心房水平，隨后連接至ECMO靜脈引流端。以上所有血管遠(yuǎn)端絲線結(jié)扎，近端絲線固定，以防止置管部位出血和插管脫出。

1.4 ECMO管路及設(shè)備 ECMO系統(tǒng)組成（如圖1）包括:蠕動(dòng)泵（常州普瑞流體技術(shù)有限公司）及配套硅膠軟管，10 ml注射器，特制小動(dòng)物膜式氧合器（東莞科威醫(yī)療用品公司）。ECMO系統(tǒng)預(yù)充排氣，采用8 ml 6%羥乙基淀粉進(jìn)行無血預(yù)充。

圖1 大鼠ECMO系統(tǒng)組成

1.5 轉(zhuǎn)流過程 所有血管置管結(jié)束后與ECMO管路動(dòng)、靜脈端連接，保證管路通暢。尾靜脈取血監(jiān)測活化凝血時(shí)間（activated clotting time，ACT），ACT 達(dá)400 s以上時(shí)開始ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)，根據(jù)引流情況調(diào)整蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速及靜脈插管位置，確保注射器液面穩(wěn)定。膜式氧合器以氧氣和氮?dú)獾幕旌蠚怏w作為氣源，氣流量的大小根據(jù)實(shí)際血?dú)饨Y(jié)果進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持pH值和二氧化碳分壓（PCO2）等相關(guān)指標(biāo)的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)監(jiān)測并記錄平均動(dòng)脈壓及心率，若出現(xiàn)血壓明顯下降，及時(shí)調(diào)整流量，必要時(shí)給予血管活性藥物維持血壓。ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間為2 h，轉(zhuǎn)中流量為10～15 ml／（kg·min）。

1.6 數(shù)據(jù)采集 各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)前、術(shù)中1 h、2 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取動(dòng)脈血?dú)夥治?，記錄各時(shí)間點(diǎn)血?dú)鈹?shù)值，并于術(shù)中實(shí)時(shí)監(jiān)測記錄平均動(dòng)脈壓及心率。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用SPSS 23.0軟件處理和統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用正態(tài)分布數(shù)據(jù)的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

5只大鼠均順利完成實(shí)驗(yàn)并于術(shù)后麻醉狀態(tài)下立即處死。所有實(shí)驗(yàn)大鼠基本資料、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血?dú)夥治鼋Y(jié)果見表1。結(jié)果提示:ECMO開始運(yùn)轉(zhuǎn)后紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）由術(shù)前0.292下降至 0.236；血紅蛋白（hemoglobin，Hb）濃度由術(shù)前 99.4 g／L 下降至 79.6 g／L；K＋濃度由術(shù)前 4.72 mmol／L 上升至 5.38 mmol／L；其他血?dú)鈪?shù)均可維持在正常范圍。ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間為2 h，轉(zhuǎn)中流量為10～15 ml／（kg·min）。

表1 基本資料、血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)夥治鼋Y(jié)果數(shù)據(jù)（n=5，±s）

表1 基本資料、血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)夥治鼋Y(jié)果數(shù)據(jù)（n=5，±s）

注:P值為術(shù)中2 h與術(shù)前的數(shù)據(jù)間的比較；TCO2:二氧化碳結(jié)合力。

參數(shù) 術(shù)前 術(shù)中1 h 術(shù)中2 h P值體重（g） 407±16.43體溫（℃） 35.23±0.32 31.18±0.45 33.87±0.13 0.0125平均動(dòng)脈壓（mm Hg） 103.25±13.24 87.52±15.46 95.74±12.68 0.0240心率（次／min） 368±21.57 329±25.74 353±23.12 0.0132 pH 7.508±0.57 7.406±0.90 7.367±0.33 0.0060 PCO2（mm Hg） 24.54±5.43 40.06±5.42 40.30±3.82 0.1518 PO2（mm Hg） 109.80±33.01 188.80±85.98 238.80±57.25 0.2256 BE（mmol／L） -3.6±2.9 -1.4±2.6 -1.4±2.3 0.2639 HCO3-（mmol／L） 19.3±3.0 23.5±2.9 24.1±1.8 0.0701 TCO2（mmol／L） 20.0±2.9 26.4±3.7 25.4±1.8 0.0754 SO2（%） 98.4±1.1 99.2±1.1 100.0±0.0 0.0051 Na＋（mmol／L） 136.0±12.1 138.0±3.9 135.8±2.8 0.0005 K＋（mmol／L） 4.72±1.85 4.74±0.63 5.38±0.20 0.0415 Ca2＋（mmol／L） 1.07±0.08 1.46±0.18 1.42±0.10 0.0889 HCT 0.29±0.04 0.24±0.01 0.26±0.01 0.0418 Hb（g／L） 99.4±13.0 79.6±5.4 87.0±3.7 0.0423

3 討 論

ECMO是搶救生命垂?；颊叩男碌捏w外生命支持技術(shù)，根據(jù)輔助支持臟器的不同可分為V-V ECMO和V-A ECMO，前者主要用于呼吸支持，后者既可以用于呼吸支持，又可以用于心臟支持。當(dāng)患者的心肺功能嚴(yán)重受損時(shí)，ECMO技術(shù)的應(yīng)用為患者的生存帶來希望。有研究顯示V-A ECMO可以改善難治性心源性休克或心臟驟停患者的生存率，但同時(shí)其治療過程中的并發(fā)癥也是不可忽視的問題［10］。建立簡單易行的動(dòng)物模型對(duì)ECMO過程中相關(guān)問題進(jìn)行研究成為時(shí)下熱點(diǎn)問題，國內(nèi)外均有關(guān)于ECMO動(dòng)物模型的報(bào)道，但是已發(fā)表的小動(dòng)物模型并不能完全模擬ECMO的病理生理［11-12］，而傳統(tǒng)大動(dòng)物模型的科研局限性較大。本課題組前期已成功建立傳統(tǒng)體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)等大鼠模型［4-9］，在模型建立方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，本研究在已有動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一定程度的技術(shù)改進(jìn)，成功建立大鼠V-A ECMO模型，使ECMO期間血流動(dòng)力學(xué)及器官損傷等問題的研究成為可能。

3.1 模型建立方法

3.1.1 充足的靜脈引流是ECMO管理的關(guān)鍵問題之一，本實(shí)驗(yàn)采用自制靜脈引流管可以保證良好的靜脈引流量，靜脈引流管軟硬度適中，靜脈內(nèi)不易打折且對(duì)血管壁損傷小，并且將靜脈引流管置于右心房水平，保證了充分且穩(wěn)定的引流。

3.1.2 ECMO作為一種密閉的體外循環(huán)系統(tǒng)，在臨床中大量應(yīng)用于心肺功能衰竭患者的治療［13-15］。但是ECMO相關(guān)問題的機(jī)制研究并不十分明確，而現(xiàn)存的帶有回流室裝置的動(dòng)物模型并不能完全模擬ECMO的病理生理過程，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，去除回流室裝置，進(jìn)一步優(yōu)化系統(tǒng)，使其更加貼近臨床ECMO的過程。去除回流室后的完全密閉的ECMO系統(tǒng)，其系統(tǒng)內(nèi)壓力的監(jiān)測是成功的關(guān)鍵，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)條件受限，很難實(shí)時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)內(nèi)壓力監(jiān)測，因此，通過改良管路，在靜脈引流端連接10 ml注射器，注射器內(nèi)用膠體預(yù)充以隔絕空氣，ECMO運(yùn)行期間通過觀察注射器內(nèi)液面的變化情況來監(jiān)測系統(tǒng)內(nèi)壓力，及時(shí)進(jìn)行調(diào)整，且過程中不會(huì)發(fā)生由于靜脈引流管貼壁引起體外循環(huán)管路進(jìn)氣等狀況。在該實(shí)驗(yàn)中用蠕動(dòng)泵代替?zhèn)鹘y(tǒng)的滾壓泵，可以更加精細(xì)的進(jìn)行流量調(diào)節(jié)，且方便操作，進(jìn)一步減少系統(tǒng)預(yù)充量，達(dá)到無血預(yù)充，對(duì)大鼠的創(chuàng)傷小，也使得ECMO的過程更加平穩(wěn)，易于管理的同時(shí)也大大提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 所有大鼠均順利完成實(shí)驗(yàn)。表1數(shù)據(jù)顯示ECMO開始運(yùn)轉(zhuǎn)后實(shí)驗(yàn)大鼠的體溫、平均動(dòng)脈壓及心率均有明顯下降，考慮原因?yàn)閂-A ECMO模型并不能完全模擬生理過程，會(huì)對(duì)大鼠機(jī)體帶來一定程度的影響，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，但是數(shù)據(jù)的絕對(duì)值變化并無明顯臨床意義。表2血?dú)夥治鰯?shù)據(jù)結(jié)果顯示，ECMO的運(yùn)轉(zhuǎn)以及膜式氧合器的使用為非生理狀態(tài)，因此會(huì)對(duì)機(jī)體酸堿平衡帶來一定程度的影響。由于本實(shí)驗(yàn)采用無血預(yù)充，ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)過程中血液稀釋較為明顯，導(dǎo)致離子濃度、HCT、Hb等指標(biāo)的改變。ECMO運(yùn)行期間靜脈端注射器液面平穩(wěn)，無明顯下降，提示系統(tǒng)內(nèi)未出現(xiàn)負(fù)壓過大的情況；而鉀離子濃度呈現(xiàn)上升趨勢，考慮與血液破壞有關(guān)，可能是由于該實(shí)驗(yàn)使用的膜式氧合器并未達(dá)到臨床ECMO要求的低阻力膜式氧合器的工藝標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝以減少血液破壞。

3.3 實(shí)驗(yàn)存在不足 由于本實(shí)驗(yàn)屬于V-A ECMO大鼠模型的初步探索，因此ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間較短，選用的是健康大鼠，與實(shí)際臨床應(yīng)用仍存在不同，為更好探索ECMO對(duì)臟器帶來的影響，需要進(jìn)一步延長ECMO運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，在大鼠疾病模型上進(jìn)行ECMO的研究，使得大鼠ECMO期間的病理生理改變更加接近臨床。本實(shí)驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵代替?zhèn)鹘y(tǒng)滾壓泵，流量更加精細(xì)可控，但是與臨床應(yīng)用的離心泵原理不同，膜式氧合器也不能完全達(dá)到臨床上的使用標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)系統(tǒng)的進(jìn)一步改良，使該模型對(duì)臨床問題更加具有指導(dǎo)意義是接下來的研究和探索重點(diǎn)所在。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在保證充分的引流量和灌注流量的情況下，對(duì)原有動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步改良，成功建立了大鼠外周V-A ECMO模型。該動(dòng)物模型在系統(tǒng)組成方面十分接近ECMO的臨床應(yīng)用，因此尤其適用于V-A ECMO期間血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究。該模型操作簡單，成功率高，術(shù)中麻醉深度可控，大鼠生命體征平穩(wěn)，為ECMO期間的病理生理學(xué)研究、臟器損傷研究，以及干預(yù)治療措施的探討奠定基礎(chǔ)。