NA單藥及序貫聯(lián)合Peg干擾素對慢乙肝患者CD11c+mDC功能的影響

（大連市第六人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000）

HBV感染是一個嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，全世界慢性乙型肝炎（慢乙肝）感染者的人數(shù)超過3.5億人。中國是世界上感染乙型肝炎病毒人數(shù)最多的國家。目前中國約有9300萬例乙型肝炎病毒攜帶者，其中慢乙肝患者2000萬～3000萬，每年近30萬人死于與乙型肝炎相關(guān)的肝硬化和肝癌等。慢乙肝仍然是肆虐我國的重要疾病。HBV感染的慢性進(jìn)展決定了抗病毒治療是一個慢性過程，至今公認(rèn)的抗HBV治療藥物有干擾素（IFN-α）和核苷（酸）類 似物（NA）兩大類?，F(xiàn)有的這兩大類抗HBV藥物各有優(yōu)缺點(diǎn)：NA抗病毒起效快，但1年HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率低，即便延長療程，轉(zhuǎn)換率也很難提高，且療程不固定，雖具有調(diào)節(jié)免疫的功能，但免疫功能調(diào)節(jié)不持久，大多數(shù)人不能實(shí)現(xiàn)停藥；而IFN-α直接抗病毒作用較弱，抗病毒起效較慢，但其具有療程相對固定，不易病毒耐藥，HBeAg和HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高且應(yīng)答持久，具有調(diào)節(jié)免疫和抗病毒雙重功效的優(yōu)勢。因此，優(yōu)化現(xiàn)有抗HBV治療方法具有重要意義。因二者抗HBV作用靶位及機(jī)制不同，聯(lián)合應(yīng)用理論上可實(shí)現(xiàn)其優(yōu)勢互補(bǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象：收集我院接受NA單藥治療和序貫Peg干擾素患者基線、治療24周及治療48周時的外周血各10 mL（單藥及序貫組各20例）；并選取健康對照10例。序貫Peg干擾素的時機(jī)：HBeAg陽性的慢乙肝患者核苷類藥物應(yīng)用3個月，HBeAg水平較基線下降大于50%；和（或）HBSAg低于1500 IU/mL；核苷類藥物應(yīng)用3個月～2年的慢乙肝患者，HBeAg低于500 S/CO，和（或）HBSAg低于10000 IU/mL。入組標(biāo)準(zhǔn)：入組CHB患者均為大連市第六人民醫(yī)院住院及門診患者。診斷符合2000年《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)。年齡＜50歲，男女不限，6個月內(nèi)未使用任何抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑。健康對照組無感染乙、丙型肝炎病毒及各種過敏史，肝功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除人類免疫缺陷病毒、HCV及丁型、戊型肝炎病毒感染。退出和終止標(biāo)準(zhǔn)：抗病毒治療依從性差，中途停止抗病毒治療者。研究參與者參加研究的時間：48周。招募過程：臨床診療過程中招募符合入組標(biāo)準(zhǔn)的核苷類藥物及序貫聯(lián)合Peg干擾素受試者。

1.2 主要試劑及儀器：異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記鼠抗人譜系標(biāo)記（包括CD3、CD14、CD16，CD19、CD20、CD56）單克隆抗體購自美國Caltag公司；藻紅蛋白（PE）-CD11c+，別藻藍(lán)蛋白（APC）HLA-DR購自美國eBioscience公司。細(xì)胞周期流式檢測試劑盒。

1.3 方法：①外周血mDC頻率檢測：分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次，加入FITC標(biāo)記的Lineage（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56），PE標(biāo)記的CD11c，APC標(biāo)記的HLA-DR mAb各10 μL，室溫避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min，10 g/L多聚甲醛固定，同時設(shè)同型對照，上流式細(xì)胞儀檢測。Lineage CD11c+和HLA-DR+雙陽性的細(xì)胞為mDC。②外周血流式細(xì)胞儀檢測髓樣樹突細(xì)胞mDC表面共刺激分子CD80，CD86的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血mDC頻率的變化：通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測特異性表面膜標(biāo)志，譜系標(biāo)記lineage（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）陰性，CD11c、HLA-DR雙陽性為mDC亞群.對于20例NA單藥組慢乙肝患者及20例序貫聯(lián)合Peg干擾素組患者外周血mDC占PBMC的百分比進(jìn)行檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05），序貫聯(lián)合組外周血mDC占PBMC的百分比明顯高于單藥治療組（0.77±0.56）%VS （0.38±0.61）%，P＜0.05。

2.2 外周血流式細(xì)胞儀檢測髓樣樹突細(xì)胞mDC表面共刺激分子CD80，CD86，HLA-DR的表達(dá)。NA單藥組CD80和CD86表達(dá)率分別為（2.35±0.72）%、（18.71±10.93）%，序貫聯(lián)合Peg干擾素組CD80和CD86表達(dá)率為（6.87±8.15）%、（45.26±21.54）%，序貫聯(lián)合Peg干擾素組表達(dá)率高于單藥治療組（P＜0.05），兩組CD80表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

DC在慢性感染患者對HBV的低應(yīng)答或無應(yīng)答的免疫反應(yīng)中起著重要作用[1]，現(xiàn)認(rèn)為其機(jī)制是DC的免疫調(diào)節(jié)和抗原提呈功能有特異性的缺陷導(dǎo)致HBV慢性持續(xù)性感染。DC按照細(xì)胞表面分子特點(diǎn)分為髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloid Dendritic Cell，mDC）和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid Dendritic Cell，pDC）兩個亞群，其中mDC主要發(fā)揮抗原遞呈功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化和細(xì)胞免疫的發(fā)生。乙型肝炎患者體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對HBV應(yīng)答的強(qiáng)度是決定病毒能否被清除的主要因素，體內(nèi)高水平的病毒載量導(dǎo)致了持續(xù)低下的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

有研究表明：針對我國慢乙肝患者以基因C型為主，兩種藥物單用整體停藥率均低，療效不高；所以二者聯(lián)合是否能取得更好的抗病毒效果是人們一直在探索研究的方向。我國學(xué)者任紅等進(jìn)行的一項(xiàng)全國多中心隨機(jī)開放研究（NewSwitch）顯示核苷（酸）類似物治療1～3年達(dá)到HBV-DNA＜200 IU/mL及HBeAg清除的患者序貫Peg-IFN治療48周可實(shí)現(xiàn)較高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率和血清轉(zhuǎn)換率（16.2%，12.5%），使用Peg-IFN前HBsAg低水平者有更高的表面抗原清除率；OSST研究是寧琴教授在我國開展的一項(xiàng)全國多中心，隨機(jī)對照臨床研究，研究結(jié)果表明：應(yīng)用恩替卡韋治療獲得病毒學(xué)抑制的患者聯(lián)合/序貫至有限療程的聚乙二醇干擾素（Peg-IFN）治療，可顯著提高患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率和HBsAg清除率；荷蘭學(xué)者Brouwer等[2]對2項(xiàng)全球性RCT研究（HBV9901研究和ARES研究）進(jìn)行析因分析，該研究得出在ETV基礎(chǔ)上聯(lián)合24周Peg-IFN-α治療，后續(xù)ETV治療的方案更優(yōu)越。以上三項(xiàng)研究均證實(shí)聯(lián)合治療抗病毒作用更顯著。上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院的謝青教授和她的團(tuán)隊(duì)在2008年研究發(fā)現(xiàn)：CHB患者外周血mDC頻數(shù)與血清HBV病毒載量及血清ALT水平存在負(fù)相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)CD11c+mDC作為發(fā)揮抗原提呈，促進(jìn)Th1細(xì)胞極化和細(xì)胞免疫的重要始動因子，其功能的降低是CHB產(chǎn)生免疫耐受的原因之一。另外，HBV患者mDC分泌IL-12水平低下，可能是HBV持續(xù)感染機(jī)體免疫難以清除的另一原因[3-4]。

近年來的研究證實(shí)初始聯(lián)合并沒有顯著提高HBeAg的血清轉(zhuǎn)換率；而先用NA降低病毒載量，使細(xì)胞免疫功能得到短暫的恢復(fù)，同時序貫聯(lián)合長效干擾素可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能，增強(qiáng)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和HBsAg的清除。但目前慢乙肝防治指南中并未推薦序貫聯(lián)合治療方案，考慮可能與其免疫學(xué)機(jī)制不清有關(guān)。

本次研究得出結(jié)論：①NA聯(lián)合Peg干擾素較單用NA可以的提高CHB患者外周血mDC頻數(shù)；DC是功能強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)特異T細(xì)胞反應(yīng)中起非常重要的作用[5-6]。近幾年，國內(nèi)外諸多文獻(xiàn)報道慢乙肝患者外周血樹突狀細(xì)胞數(shù)量、表型及功能均存在異常[7-9]，本研究證實(shí)聯(lián)合治療可以提高CD11c+m功能，激活天然免疫，啟動更持久的適應(yīng)性免疫，進(jìn)一步提高CHB患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換率，提高病毒DNA的清除率，縮短治療療程。②聯(lián)合治療可以提高CD11c+mDC表面共刺激因子CD80，CD86表達(dá)率；本研究的結(jié)果證實(shí)序貫聯(lián)合治療能夠有效刺激CD11c+mDC的活化，明顯上調(diào)細(xì)胞表面CD80、CD86的表達(dá)，表明序貫聯(lián)合治療可能通過調(diào)節(jié)CD11c+mDC的表型和功能，參與HBV的控制和清除，這將為下一步深人研究序貫聯(lián)合在HBV感染中的免疫本質(zhì)，具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與調(diào)控環(huán)節(jié)提供理論依據(jù)[10]。

因此，結(jié)合我們的研究，初步得出結(jié)論NA序貫聯(lián)合Peg干擾素可以提高CD11c+mDC的功能，激活天然免疫，啟動更持久的適應(yīng)性免疫。本課題的意義在于從免疫學(xué)機(jī)制方面研究干擾素抗病毒的作用，進(jìn)一步為患者提供更好的治療方案，為我市病毒性肝炎的防治做出貢獻(xiàn)，使我市年輕的慢乙肝患者實(shí)現(xiàn)停藥；而且我國目前干擾素應(yīng)用比例較低，整體不足10%，我市應(yīng)用比例更低，本研究擬改變對干擾素認(rèn)識不足，整體應(yīng)用低下的局面，為患者提供更優(yōu)化的治療方案。