紫鉚花素對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)線粒體功能的影響研究

劉珂娣 段佳林 蘇晶 陶星茹 趙石 白楊 衛(wèi)培峰 奚苗苗

摘 要 目的：研究紫鉚花素對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)線粒體功能的影響。方法：將大鼠PC12細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、溶劑對(duì)照組（1‰二甲基亞砜）和紫鉚花素高、中、低濃度組（2、1、0.5 μmol/L）。后4組給予相應(yīng)試劑/藥物干預(yù)24 h后，除正常對(duì)照組外的其余組均以100 mU/mL葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型。培養(yǎng)4 h后，檢測(cè)細(xì)胞存活率、凋亡率和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、三磷酸腺苷（ATP）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平或活性以及線粒體膜電位（MMP）變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率和SOD、CAT、GSH-Px、ATP活性或水平均顯著降低，凋亡率、ROS含量和MDA、IL-1β、TNF-α水平均顯著增加（P<0.05或P<0.01），MMP明顯降低。與模型組比較，溶劑對(duì)照組上述指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞存活率和SOD（除中、低濃度組外）、CAT、GSH-Px（除中、低濃度組外）、ATP（除低濃度組外）活性或水平均顯著升高，凋亡率、ROS含量和MDA、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），MMP明顯增加。結(jié)論：紫鉚花素可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，穩(wěn)定線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，增加能量生成，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

關(guān)鍵詞 紫鉚花素;PC12細(xì)胞;氧化應(yīng)激;線粒體功能;炎癥;細(xì)胞凋亡;神經(jīng)保護(hù)

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the protective effects of butein on oxidative stress injury of PC12 cell and its effects on mitochondrial function. METHODS： Rats PC12 cells were divided into normal control group， model group， solvent control group （1 ‰ dimethyl sulfoxide）， butein high， medium and low concentration groups （2， 1， 0.5 μmol/L）. The latter 4 groups were given relevant ?reagent/medicine for intervention; 24 h later， other groups were given 100 mU/mL glucose oxidase to induce oxidant stress model except for normal control group. After 4 h culture， cell survival rate， apoptosis rate， the levels or activities of ROS， MDA， SOD， CAT， GSH-Px， ATP， IL-1β and TNF-α as well as the change of MMP were detected. RESULTS：Compared with normal control group， cell survival rate， the levels or activities of SOD， CAT， GSH-Px and ATP were all decreased significantly， and apoptotic rate， the content of ROS， the levels of MDA， IL-1β and TNF-α were all increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the MMP was decreased significantly. Compared with model group， above indexes of solvent control group had no significant change （P>0.05）， cell survival rates， the levels or activities of SOD （except for medium and low concentration groups）， CAT， GSH-Px （except for medium and low concentration groups）， ATP （except for low concentration group） were increased significantly in butein high， medium and low concentration groups， while apoptotic rates， the content of ROS， the levels of MDA， IL-1β and TNF-α were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the MMP were increased significantly. CONCLUSIONS：Butein can increase the antioxidant enzyme activity， stabilize mitochondrial function， inhibit oxidative stress and inflammationthus， increase energy generation inhibiting neuronal cell apoptosis ultimately exerting a neuroprotective effect.

KEYWORD ? Butein; PC12 cell; Oxidative stress; Mito- chondrial function; Inflammation; Apoptosis; Neuroprotection

腦卒中是威脅人類健康的重大疾病，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，具有死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[1]。該病分為缺血性卒中（Ischemic stroke，IS）和出血性卒中（Hemorrhagic stroke，HS），其中超過75%的腦卒中為IS[1]。IS是由大腦局部血流循環(huán)障礙、腦組織缺血缺氧所導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷綜合征，其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、能量代謝紊亂、炎癥、細(xì)胞凋亡等多種因素密切相關(guān)[2]。腦缺血時(shí)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡[3-4]，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)、外膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，線粒體氧化應(yīng)激加重，線粒體膜電位（MMP）下降難以維持線粒體的氧化磷酸化過程，使得三磷酸腺苷（ATP）合成顯著下降，細(xì)胞呼吸與能量轉(zhuǎn)換紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子釋放，加重炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷[5-7]?？梢?，線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所，以線粒體為靶點(diǎn)治療IS的研究策略受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，臨床常用的IS治療手段包括溶栓藥物和神經(jīng)介入技術(shù)，但由于二者的治療時(shí)間窗狹窄，使得其治療效果受到了嚴(yán)重的影響[8-9]，故尋找新的治療手段迫在眉睫。

中醫(yī)稱腦卒中為“中風(fēng)”，始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。清代醫(yī)家王清任認(rèn)為，氣虛血瘀為中風(fēng)病的病機(jī)，歷代醫(yī)家也常以活血化瘀類中藥治療中風(fēng)[10]。紫鉚花素（Butein）是從活血化瘀類中藥降香中提取的主要活性成分，屬于黃酮類化合物中的查爾酮類（結(jié)構(gòu)式見圖1）[11]。本課題組前期研究結(jié)果表明，紫鉚花素可改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制心肌細(xì)胞損傷，具有心肌保護(hù)作用[12]。但該化合物是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制是否與線粒體能量代謝有關(guān)尚未見報(bào)道。基于此，本研究以葡萄糖氧化酶（GOD）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型為對(duì)象，探討紫鉚花素對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其對(duì)線粒體功能的影響，旨在為尋找神經(jīng)保護(hù)類藥物提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

371型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Sky型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Accuric 6型流式細(xì)胞儀[碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司];A1型激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）;TD4型臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;BSA124S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];THZ-100型恒溫?fù)u床（上海一恒儀器有限公司）;QL901型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

紫鉚花素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T18J6C1，純度：≥98%）;GOD（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：329J021）;胎牛血清（FBS，以色列BI公司，批號(hào)：1928625）;青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)：30002317）、胰蛋白酶消化液（批號(hào)：30119014）、杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS，pH=7.4，批號(hào)：21031012）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1001303）均購(gòu)自美國(guó)Corning公司;二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)MP公司，批號(hào)：Y181007）;CCK-8試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：C6901030）;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20190528）;ROS（批號(hào)：20190606）、丙二醛（MDA，批號(hào)：20190618）、超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)：20190625）、過氧化氫酶（CAT，批號(hào)：20190628）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號(hào)：20190625）、ATP（批號(hào)：20190708）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;MMP檢測(cè)試劑盒（JC-1染色）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120919190613）;白細(xì)胞介素1β（IL-1β，批號(hào)：201909）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號(hào)：201909）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12神經(jīng)細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)教研室贈(zèng)予。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（即含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基），置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每2天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代。

2.2 細(xì)胞分組與處理

將PC12細(xì)胞分為6組，分組與處理——正常對(duì)照組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組：含100 mU/mL（濃度根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）GOD的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（即無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)4 h;溶劑對(duì)照組：先用含1‰DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再用含100 mU/mL GOD的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h;紫鉚花素高、中、低濃度組：先用含2、1、0.5 μmol/L紫鉚花素（溶劑為1‰DMSO，濃度根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含100 mU/mL GOD的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。

2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

以5×104個(gè)/孔將PC12細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、處理，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞和藥物的空白對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。建模培養(yǎng)4 h后，更換含10%CCK-8的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（OD試驗(yàn)組-OD空白對(duì)照組）/（OD正常對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

以5×105個(gè)/孔將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。建模培養(yǎng)4 h后，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，D-PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入AnnexinⅤ-FITC和PI染色試劑各3 μL，吹勻，避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)

以5×105個(gè)/孔將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。建模培養(yǎng)4 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，D-PBS洗1次，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將ROS試劑盒中的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）染色液稀釋至10 μmol/L，每孔加入上述染色液1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄去培養(yǎng)基，D-PBS洗3次，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，每管加入D-PBS 500 μL，吹勻，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、GSH-Px、ATP、IL-1β、TNF-α水平檢測(cè)

以5×105個(gè)/孔將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。建模培養(yǎng)4 h后，按照試劑盒說明書處理細(xì)胞后，收集上清液，以比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)蛋白（MDA、SOD、CAT、GSH-Px）、ATP水平或活性，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子（IL-1β、TNF-α）水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞MMP觀察

以5×105個(gè)/孔將PC12細(xì)胞接種于放置有細(xì)胞爬片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.2” 項(xiàng)下方法分組、處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。建模培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入JC-1染色工作液1 mL，孵育20 min后，用JC-1染色緩沖液（1×）輕輕洗3遍，每孔再加入完全培養(yǎng)基1 mL，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），提示GOD引起PC12細(xì)胞存活率下降。與模型組比較，溶劑對(duì)照組細(xì)胞存活率無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），提示紫鉚花素可提高PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷后的存活率。各組細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果見圖2。

3.2 細(xì)胞凋亡率

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），提示GOD可導(dǎo)致PC12細(xì)胞凋亡。與模型組比較，溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），提示紫鉚花素可抑制GOD引起的PC12細(xì)胞凋亡。各組細(xì)胞的凋亡散點(diǎn)圖見圖3，凋亡率檢測(cè)結(jié)果見圖4。

3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS含量

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高（P<0.01），提示GOD可導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加。與模型組比較，溶劑對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS含量無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞內(nèi)ROS含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），提示紫鉚花素可清除細(xì)胞內(nèi)ROS。各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)結(jié)果見圖5。

3.4 細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)蛋白活性或水平

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01），提示GOD可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，氧化-抗氧化體系失衡，抗氧化酶活性下降。與模型組比較，溶劑對(duì)照組上述指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞內(nèi)MDA水平均顯著降低，紫鉚花素高、中、低濃度組CAT活性和高濃度組SOD、GSH-Px活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;而紫鉚花素中、低濃度組雖有增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性的趨勢(shì)，但與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示紫鉚花素可提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減輕GOD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。各組細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)蛋白活性或水平檢測(cè)結(jié)果見圖6。

3.5 細(xì)胞ATP水平

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ATP水平顯著降低（P<0.01），提示GOD可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體能量代謝紊亂，使ATP合成顯著下降。與模型組比較，溶劑對(duì)照組細(xì)胞ATP水平無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中濃度組細(xì)胞ATP水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），而低濃度組雖有提高細(xì)胞ATP水平的趨勢(shì)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示紫鉚花素可改善GOD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的線粒體代謝紊亂，增加ATP合成。各組細(xì)胞ATP水平檢測(cè)結(jié)果見圖7。

3.6 細(xì)胞內(nèi)炎癥因子水平

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01），提示GOD可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎癥發(fā)生。與模型組比較，溶劑對(duì)照組上述指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05），紫鉚花素高、中、 低濃度組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），提示紫鉚花素可抑制GOD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)。各組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α水平檢測(cè)結(jié)果見圖8。

3.7 細(xì)胞MMP

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光增強(qiáng)，紅色熒光減弱，細(xì)胞MMP明顯降低，提示GOD可導(dǎo)致PC12細(xì)胞線粒體功能受損。與模型組比較，溶劑對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光均無明顯變化，紫鉚花素高、中、低濃度組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光均增強(qiáng)，綠色熒光均減弱，細(xì)胞MMP明顯增加，提示紫鉚花素可通過穩(wěn)定MMP改善線粒體功能而緩解GOD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。各組細(xì)胞MMP的熒光顯微圖見圖9（圖中，紅色熒光表示MMP較高，綠色熒光表示MMP較低）。

4 討論

已有研究表明，IS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激是其發(fā)生、發(fā)展的重要病理因素之一。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ROS過度積累可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化系統(tǒng)紊亂，體內(nèi)氧自由基代謝失衡誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激，損傷線粒體，使細(xì)胞MMP下降;同時(shí)，線粒體氧化磷酸化受限，ATP合成減少，線粒體能量代謝失調(diào)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終損傷腦組織神經(jīng)元[13-17]。

本研究采用的GOD致?lián)p傷細(xì)胞模型為典型的氧化應(yīng)激模型。傳統(tǒng)的氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)劑為過氧化氫（H2O2），見光易分解，性質(zhì)極不穩(wěn)定;而GOD是一種生物催化劑，能夠模擬氧化環(huán)境，參與體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，催化氧氣穩(wěn)定生成H2O2，進(jìn)而產(chǎn)生大量的羥自由基（·OH）以誘導(dǎo)并加劇蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷[18]。本研究通過檢測(cè)紫鉚花素對(duì)GOD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型細(xì)胞活性及凋亡的影響來評(píng)價(jià)該化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的改善作用。結(jié)果表明，紫鉚花素不同劑量組均可促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡。

紫鉚花素的分子結(jié)構(gòu)中含有抗氧化活性基團(tuán)鄰二酚羥基，提示其對(duì)氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞的改善作用可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。Cheng ZJ等[15]的研究也證實(shí)，紫鉚花素可通過清除多種自由基及螯合金屬離子，抑制Fe2+誘導(dǎo)的大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并可通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少ROS的生成。ROS是自由基的統(tǒng)稱，其主要成員的分子結(jié)構(gòu)中都含有氧原子，具有極強(qiáng)的氧化能力，如超氧陰離子自由基（·O2-）、H2O2、·OH等[19]。堆積的ROS不僅能與膜磷脂的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還可與一氧化氮形成過氧亞硝酸根離子（ONOO-）以促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進(jìn)程;氧化產(chǎn)物MDA破壞細(xì)胞膜完整性，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變離子運(yùn)輸，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙[20]，其含量高低在一定程度上可直接或間接反映脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度[21]。本研究結(jié)果表明，不同濃度紫鉚花素對(duì)氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平均有顯著抑制作用，這可能與其脂溶性較強(qiáng)，可進(jìn)入細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層發(fā)揮作用相關(guān);同時(shí)，這也提示紫鉚花素抑制PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)程、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA水平、抑制細(xì)胞氧化-抗氧化系統(tǒng)中的氧化進(jìn)程有關(guān)。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)紫鉚花素對(duì)氧化-抗氧化系統(tǒng)中抗氧化屏障的影響，本研究檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活性。機(jī)體內(nèi)源性清除氧自由基的抗氧化酶主要是SOD、GSH-Px、CAT。其中，SOD能清除·O2-，避免細(xì)胞氧化應(yīng)激，該指標(biāo)活性水平能間接反應(yīng)機(jī)體氧自由基反應(yīng)程度和清除能力;GSH-Px主要清除細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的·OH和過氧化物，減少細(xì)胞膜不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化;CAT的主要功能是清除生物體內(nèi)的H2O2[22]，且GSH-Px能和CAT共同催化SOD分解的氧自由基產(chǎn)物H2O2代謝為H2O和O2，降低體內(nèi)H2O2水平，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[23-24]。有研究表明，紫鉚花素可以抑制谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷，維持SOD、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶的活性不因谷氨酸損傷而降低，減少ROS的產(chǎn)生，從而保護(hù)小鼠海馬神經(jīng)元[25]。另外，姜辰等[7]認(rèn)為，抗氧化物與自由基之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，抗氧化系統(tǒng)失衡，線粒體膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體功能受損，線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而使IS加重。本研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚花素不同濃度組能顯著升高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活性，提高細(xì)胞抗氧化屏障，增加抗氧化能力，提示紫鉚花素可能是通過提高抗氧化酶活性進(jìn)而提高抗氧化屏障，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)抗氧化進(jìn)程，進(jìn)一步抑制線粒體氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

線粒體是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，細(xì)胞生命活動(dòng)提供所需要的能量基本都是由線粒體提供，故其被稱為“能量工廠”[26]。線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)、外膜通透性的差異可以使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成質(zhì)子梯度，這是維持線粒體膜電勢(shì)的關(guān)鍵因素，也是推動(dòng)ATP合成的先決條件[27]。正常的MMP是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能;而病理狀態(tài)下，大量產(chǎn)生的ROS可造成線粒體膜脂質(zhì)過氧化，線粒體氧化應(yīng)激破壞了膜的完整性和通透性，使氧化磷酸化減少或不能進(jìn)行，導(dǎo)致MMP降低，ATP產(chǎn)生迅速減少，細(xì)胞呼吸和能量轉(zhuǎn)化紊亂，線粒體功能異常，誘發(fā)促炎因子釋放，增加炎癥反應(yīng)發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[28-29]。李強(qiáng)等[30]發(fā)現(xiàn)，線粒體中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高時(shí)，ROS水平顯著增高，MMP持續(xù)下降，ATP合成顯著減少，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或壞死。本研究中，紫鉚花素不同濃度組可能通過抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激，穩(wěn)定細(xì)胞線粒體MMP，增加線粒體膜的通透性，增加ATP的合成，恢復(fù)線粒體的能量供給，增強(qiáng)線粒體功能，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

ROS蓄積會(huì)導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化，線粒體氧化應(yīng)激加重[31]，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致促炎因子TNF-α和IL-1β釋放增加，直接或間接誘導(dǎo)神經(jīng)毒性介質(zhì)的產(chǎn)生，增加血腦屏障通透性，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重神經(jīng)元損傷[32-33]。已有研究報(bào)道，紫鉚花素能有效抑制炎癥反應(yīng)，顯著降低炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平，且能抑制ROS生成，降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)作用[34]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞炎癥因子的水平，結(jié)果表明，紫鉚花素對(duì)氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α和IL-1β均有顯著抑制作用，提示該化合物可能通過降低線粒體氧化應(yīng)激，穩(wěn)定線粒體功能，進(jìn)一步降低炎癥反應(yīng)，減輕炎癥損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

綜上所述，紫鉚花素可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少ROS生成，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激，穩(wěn)定MMP，增加能量生成，減少炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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（收稿日期：2020-09-27 修回日期：2020-11-24）

（編輯：鄒麗娟）