肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠實驗模型研究進展

柳榮，申睿，朱向東，高艷奎，王歡，鐘興騰

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以大腸(結(jié)腸與直腸)黏膜與黏膜下炎癥為主要特征的慢性非特異性炎癥性疾病，其病因病機尚不明確。目前本病病因、病機尚不夠明確，其病程漫長，常反復發(fā)作，為現(xiàn)代難治病之一。臨床研究表明[1]，心理社會因素的應激可引起胃腸道功能紊亂，約有74%UC患者認為，社會心理因素對UC有很大影響[2]。也有學者認為[3]情志因素為炎癥性腸病復發(fā)的獨立危險因素。而與之密切相關(guān)的肝郁脾虛證是UC的主要證型之一。中醫(yī)藥治療UC具有廣闊的前景，借助于動物模型的間接研究，可以排除很多干擾因素，并且更有效地認識UC的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，同時也避免了人體實驗造成的傷害，但目前肝郁脾虛型UC動物模型的建立尚無統(tǒng)一的標準。因此，選擇建立正確合理的動物模型，探討其病因病機以及中醫(yī)藥應用等具有重要意義。目前肝郁脾虛型UC動物模型的建立方法有單純理化因素造模，單純中醫(yī)理論造模和病證結(jié)合造模，現(xiàn)將近年來關(guān)于肝郁脾虛型UC大鼠模型的研究進展綜述如下。

1 單純化學藥物模型—CCl4注射法

二十世紀70年代末期湖南醫(yī)科大第一附院的陳國楨等[4]最早用CCl4建立了小鼠慢性中毒的肝郁脾虛證模型。CCl4為有毒物質(zhì)，可損傷肝、脾、腎、胰、腸等多臟器。據(jù)研究表明[4]，當慢性CCl4中毒時，腸黏膜表層出現(xiàn)潰破，固有膜內(nèi)有明顯水腫及炎細胞浸潤，微絨毛因水腫而肥大變短，故此法理論上適用于建造肝郁脾虛型UC模型。造模方法為：取雄性大鼠，皮下注射10%CCl4花生油溶液，5 mL/kg，每周2次，共4周，首次劑量加倍。

CCl4注射法造模僅使用理化刺激建立模型，僅片面的造成大鼠大腸、肝臟、脾臟等的損傷，片面的將肝臟、脾臟損傷視為肝郁脾虛是十分荒謬的，其忽視了中醫(yī)整體觀念，錯誤的將中醫(yī)肝脾與西醫(yī)肝臟、脾臟混為一談，故其模擬出的動物模型很難真實地反應中醫(yī)證候特點。此外，此模型制作2年后，實驗大鼠肝臟仍有結(jié)節(jié)、假小葉存在，對UC模型來說干擾因素極大。此法近年來已經(jīng)很少有人使用。

2 束縛式模型

UC的病因至今仍不明確，其心理因素在疾病產(chǎn)生、惡化中具有重要地位。束縛式動物模型為肝郁脾虛型動物模型中最為常見的造模方式，將動物進行捆綁，從而使其肝氣郁滯，情志不暢，進而引起精神抑郁；氣郁化火，肝失柔順之性，則急躁易怒；肝氣橫逆犯脾，脾氣虛弱，不能運化水谷，則食少腹脹；氣滯濕阻，則腸鳴矢氣，便溏不爽，或溏結(jié)不調(diào)；肝氣犯脾，氣機郁結(jié)，運化失常，故腹痛則瀉。

2.1 單純束縛模型

單純束縛模型現(xiàn)有四肢捆綁束縛[5]、模具束縛等[6-7]方法，束縛時間為7～21 d[5-7]，以21 d最為常見，每日束縛時間為3～8 h不等，以8 h為最常見。此種模型采用束縛激怒大鼠使大鼠肝脾功能失調(diào)、脾虛肝郁，此方法符合中醫(yī)整體觀念，但此種造模方式的穩(wěn)定性、可靠性和可重復性差。經(jīng)過束縛引起致病的強度、病程持續(xù)時間以及大鼠的個體耐受度差異使此模型難以進行統(tǒng)一化處理，并且大鼠模型的自然恢復速度極快，造模不可控因素較多，難度大。且此方法主要針對制造肝郁脾虛證型模型，其對是否成功制造UC模型無可靠性依據(jù)和穩(wěn)定性。

2.2 限制活動+限制飲食+三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌腸模型

TNBS是一種半抗原物質(zhì)，與大分子組織蛋白結(jié)合后成為一種抗原物質(zhì)，引起體內(nèi)免疫機能反應進而誘發(fā)腸道炎癥。乙醇可刺激并損傷結(jié)腸黏膜，使黏膜屏障遭到破壞。造模方法：大鼠禁食后麻醉，從肛門插入導管深6～8 cm后，注入100 mg/kgTNBS+ 50%的乙醇0.25 mL的混合溶液，倒置30 s。此法可造成1～2周左右的炎癥[8]。此種造模方式目前可見兩種，一種于限制飲食限制活動整體結(jié)束后進行TNBS/乙醇混合液灌腸造模，邱家權(quán)[9]、程小麗[10]、曹燕飛[11]等采用此方法造模，此方法限制飲食限制活動時間為2～3 w[9-11]，以3 w為常見。另一種為先限制飲食限制活動，1 w后進行TNBS/乙醇混合液灌腸造模，然后再進行2 w限制飲食限制活動造模。谷松[12]、毛穎[13]、秦震聲[14]、王軼[15]等均采用此種方法造模，造模過程中大鼠逐漸出現(xiàn)胡須下垂、扎堆、懶動、飲食減少、細聲尖叫、毛少光澤等肝郁脾虛證癥狀。

此種模型為病證結(jié)合動物模型，其具有中醫(yī)病因病理理論依據(jù)，且在其模型建立后可通過動物體表特征、活動、大小便形態(tài)等評價模型，判斷其是否符合中醫(yī)證候特點，彌補了中醫(yī)傳統(tǒng)病因致病的模糊性，加強了模型的可重復性和模型建立的可靠性。該模型的建立操作簡單，可重復性高，且對動物性的傷害性較低，成功率高，是目前最常用的UC動物模型之一，適合UC免疫學角度的研究[16]。

2.3 限制活動+限制飲食+乙酸灌腸模型

上世紀70年代開始有學者運用乙酸建立大鼠 UC 模型。乙酸呈弱酸性，能增加血管通透性、促進纖維蛋白水解、干擾凝血、損傷腸道黏膜，引起炎癥反應[17]。具體方法[18]：大鼠禁食后麻醉，倒立后從肛門插入導管注入4%～5%乙酸溶液15～30 s后，注入0.9%氯化鈉溶液沖洗3次。并配合束縛刺激每天約8 h，連續(xù)3 w合并飲食失節(jié)法復制中醫(yī)證與西醫(yī)病相結(jié)合的肝郁脾虛型UC大鼠模型[19-23]。實驗后動物出現(xiàn)糞便溏瀉、腎上腺重量增加、胸腺重量下降、便血、喜扎堆、體重減輕、食欲下降等癥狀。乙酸模型操作簡單，可重復率高，短期內(nèi)可出現(xiàn)明顯癥狀，適用于急性炎癥、炎癥介質(zhì)、致炎機理及中藥抗炎機理的研究，此方法在實驗性UC模型的建立中應用非常廣泛。但由于此模型致病因素單純，乙酸刺激大腸僅可導致腸道表面損傷，與臨床致病因素有較大差異，且此種損傷容易自愈，并不適用于觀察病程長的實驗。

2.4 限制活動+限制飲食+免疫致敏+局部乙酸刺激模型

此模型的原理主要是在結(jié)腸局部發(fā)生阿瑟氏(Arthus)反應[24]，為實驗性局部過敏反應，可使局部出現(xiàn)水腫、出血和壞死等劇烈的炎癥反應。造模方法[20,23,25-28]：取大鼠的結(jié)腸黏膜組織加福氏佐劑制成免疫制劑。于第1、7、14、21天分別于足跖內(nèi)注射抗原4 mg(末次注射不加佐劑)。并于第1、7、14、21天用20%烏拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后，用導管插入大鼠肛門注入5%醋酸1 mL，用乙酸誘導結(jié)腸潰瘍。同時對大鼠進行限制活動及限制飲食，每天約8 h，連續(xù)3 w，造成肝郁脾虛型UC大鼠模型。本法重復性好，是外源物質(zhì)引起宿主反應、基因和免疫影響三者相互作用的結(jié)果，可以較好地模擬人類UC病變的慢性活動性特點，并可產(chǎn)生與人類UC較為接近的臨床癥狀及腸道病變，且此種造模方法不易自愈，可以進行周期較長的實驗。但此方法需要一定的設備、條件及掌握熟練的技術(shù)[16]。

3 夾尾法急性激怒模型

夾尾法其原理與束縛法一致，通過止血鉗夾尾激怒大鼠從而使其急躁易怒，肝氣橫逆犯脾，氣機郁結(jié)，運化失常，腹痛而泄瀉。

3.1 夾尾法急性激怒+限制飲食模型

歐陽河泉[29]認為心理、精神的不良應激和不良飲食習慣是影響胃腸道功能異常的主要病因。造模方法:每日用長海綿鑷子隔雙層紗布鉗夾鼠尾末端1/3處[30]或用塑料夾夾住鼠尾[31]，使其暴怒掙扎，并與其他大鼠持續(xù)廝打30 min，每日1～2次[30-32]；同時給予隔日進食，模擬饑飽失常。連續(xù)2 w后出現(xiàn)毛發(fā)枯黃變暗、飲食量減少、體質(zhì)量減輕、大便稀溏、伴易怒或抑郁狀態(tài)，提示造模成功。止血鉗夾尾激怒法相對較為符合肝郁脾虛證的中醫(yī)病因病機，但其反映的只是在應激狀態(tài)下的病理，其引發(fā)的大鼠受到刺激后的時間及程度都不能進行系統(tǒng)量化，是否達到“怒傷肝”的程度也無法確定，且此種病理狀態(tài)自然恢復快，故此方法所造動物模型的穩(wěn)定性、可靠性和可重復性差。

3.2 夾尾法急性激怒+限制飲食+限制活動+TNBS/乙醇溶液灌腸模型

胡政[33]采用TNBS/乙醇溶液灌腸+限制飲食+限制活動+夾尾法急性激怒法制作肝郁脾虛型UC大鼠模型。具體方法：將大鼠進行四肢束縛，同時限制飲食，每天9 h，配合間斷性夾尾刺激，每次10 min，每天4次。2周后，進行TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL)灌腸。造模后大鼠皮毛稀疏無光澤、喜扎堆貼邊、反應遲緩、大鼠飲食量減少、體重減輕、易激怒等現(xiàn)象。此造模方法較前法具體全面，但操作較為復雜，制作模型時動物差異性較大，穩(wěn)定性、可靠性和可重復性差。

4 游泳疲勞+限制飲食+限制活動模型

此方法根據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學原理，采用慢性束縛應激法建立肝郁證模型并采用過度勞累加饑飽失常法建立脾虛證模型，復制中醫(yī)肝郁脾虛證大鼠模型[34]。此造模方法目前有兩種方式，第一種[34-35]為：每日將大鼠置于盛有溫水(22±1)℃的大塑料桶中游泳10～20 min，限制自由活動3 h，在此基礎(chǔ)上可增加夾尾30 min、搖晃5 min[35]。配合隔日喂食，連續(xù)3 w。第二種[36]為：山西白醋灌胃20 mL/kg，然后把大鼠放入特制鐵筒中限制活動，使大鼠在水中站立，劍突以下浸人水中4 h，水溫控制在(20±2)℃，1次/d，連續(xù)造模10 d。此方法，第一種較為常見，但其游泳疲勞時間較短，并且為單純中醫(yī)病因復合因素模擬建模，造模具有半真實性和抽象性。第二種為中西醫(yī)病證結(jié)合動物模型，且浸泡站立疲勞時間較久，但此方式操作具有設備條件限制性，且白醋灌胃對胃腸的刺激受動物自我恢復性影響，適用于短期實驗，不適用于長期藥理療效觀察。

5 苦寒瀉下法

中醫(yī)認為，過用苦寒，久之損傷脾陽。研究發(fā)現(xiàn)[37]，脾虛證與胃腸道功能、胃腸道激素、胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，免疫學改變，神經(jīng)、內(nèi)分泌、微量元素改變等均有聯(lián)系。長期服用大黃、番瀉葉等苦寒藥物亦可導致免疫指標的下降[38]。

5.1 苦寒瀉下+限制飲食+限制活動模型

本法苦寒瀉下，損傷脾陽，配合束縛激怒大鼠，以及饑飽失常多因素造模，屬復合因素模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因建立動物模型。造模方法[39-41]：將大鼠實驗前10～12 h禁食不禁水，分別予以0.4 g/mL番瀉葉煎劑灌胃，給藥體積10 mL/kg，每日1次，合并束縛其上肢及肩背胸腹部，限制大鼠搔抓頭面部，但不限制其活動，束縛時間為1 h，連續(xù)3 w。此法符合中醫(yī)病因病理，但UC的最典型臨床表現(xiàn)為排出帶有血、膿和黏液的糞便，此方法造模后出現(xiàn)稀便，但極少伴有血、膿。

5.2 苦寒瀉下+夾尾急性激怒法模型

此法采用夾尾刺激急性激怒大鼠，“怒傷肝，久則郁”，使之肝氣橫逆犯脾，氣機失常而致泄瀉。具體方法[42]：用止血鉗夾住大鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/日，令大鼠相互撕咬、打斗，3 d后開始用大黃灌胃1.5 mL/2次，夾尾改為2次/d，15 min/次，夾尾與灌胃同時進行共10 d，期間配合隔日進食。造模后，大鼠出現(xiàn)飲食減少、體質(zhì)量減輕、扎堆、倦臥、毛發(fā)枯亂、淡漠、易暴躁、肛門污穢等肝郁脾虛癥狀。此法使用苦寒瀉下藥物通常為大黃、番瀉葉，有研究顯示[38]，番瀉葉瀉下效果比大黃強，且大黃在產(chǎn)生瀉下作用后又可出現(xiàn)便秘。大黃、番瀉葉均可使免疫指標下降，但大黃內(nèi)還含有增強免疫力等的有效成份，能與令機體暫時出現(xiàn)免疫力下降的有效成份相對峙，而番瀉葉純?yōu)a無補，可以作為苦寒瀉下藥物的首選。

6 電擊法+限制飲食+乙酸灌腸模型

電擊可對動物造成強烈刺激，使其郁怒傷肝，長期飲食失節(jié)可致動物脾虛，再結(jié)合乙酸灌腸可復制中醫(yī)“證”與西醫(yī)“病”相結(jié)合的大鼠肝郁脾虛型UC模型。張芳艷等[43]將大鼠放入電擊籠中，電壓為20～30 V，每日電擊2次，每次20 min，配合飲食失節(jié)，連續(xù)3 w，然后用乙酸灌腸誘導結(jié)腸潰瘍，制備大鼠肝郁脾虛型UC模型。此法對設備等條件要求很高，使用者較少，且電擊對動物刺激過于強烈，無法把握僅激怒大鼠，長期不定時刺激可能會造成動物恐懼，“恐傷腎”，可影響導致其他證候產(chǎn)生。

7 子母分離應激+限制活動+限制飲食模型

研究表明[44]哺乳期母子分離會導致小鼠腦組織抗氧化酶基因、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因、糖皮質(zhì)激素受體基因表達量下調(diào)以及蛋白氧化損傷，進而影響腦組織正常功能。使小鼠成年后抗抑郁能力降低，當受到外界慢性應激刺激處理時，容易產(chǎn)生抑郁樣行為。此法運用精神-神經(jīng)-外周刺激三種因素復合造模法構(gòu)建肝郁脾虛證大鼠模型。具體造模方法[45-46]：實驗用幼年SD大鼠從出生第2天起開始造模，適應性飼養(yǎng)1 w，將乳鼠取出單獨小籠飼養(yǎng)兩周，每天2～3 h，配合直腸灌注0.5%的醋酸每次0.4 mL/d。然后束縛大鼠上肢及肩胸部，束縛時間為2～3 h/d，束縛2 w，不限活動，期間進行單獨分離飼養(yǎng)。模型建立后依靠動物表征評價、動物證候評價等評價方法評價模型，判斷模型建立是否成功。

8 孤養(yǎng)+限制活動+限制飲食模型

研究表明[47]，孤養(yǎng)可導致大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進、中樞5-HT功能低下，出現(xiàn)抑郁和焦慮樣行為。郭建麗等[48]采用孤養(yǎng)配合限制飲食、限制活動的方法，將大鼠放入自制籠中，限制其自由活動，每籠1只孤養(yǎng)，每天束縛6 h。每周給大鼠不定時的禁食2次，造模時間3 w。造模后通過實驗性肝郁脾虛癥狀、體征和相關(guān)指標測試，判斷造模是否成功。

子母分離和孤養(yǎng)這兩種造模方法，都有其獨特的理論依據(jù)，但這兩種方法其概念自身具有模糊性，造模時施加病因的可控性差，且受個體差異性影響較大。

9 小結(jié)

近年來制備中醫(yī)動物模型的方法越來越多，為開展研究提供了很多途徑。但中醫(yī)動物模型的制備成功與否一直備受爭議，還存在不少問題。以上造模方法大致可分為三類，單純理化因素造模方法，單純中醫(yī)理論造模方法和病證結(jié)合造模方法。首先，單純理化因素造模方法僅使用理化因素刺激，造成動物肝臟、脾臟、大腸的損傷，將中醫(yī)肝脾與西醫(yī)肝脾混為一談，并完全忽視了造成中醫(yī)病證的病因病機，此種造模方法不符合中醫(yī)整體觀念。其次，單純中醫(yī)理論施加因素造模方法有其獨特的優(yōu)點但也存在不容忽視的缺陷，中醫(yī)是以人為整體，肝郁脾虛證型的制備均與刺激情志相關(guān)，但人和動物的情感并不能達到完全同一性，故其具有半真實性和抽象性，且中醫(yī)動物模型的穩(wěn)定性、可靠性和可重復性較差。最后，病證結(jié)合造模方法既符合中醫(yī)病因病理，又符合西醫(yī)疾病模型的建立，具有單純理化因素模型和單純中醫(yī)理論模型所不具有的優(yōu)點，但應該注意的是，目前認為UC的發(fā)病是外源物質(zhì)引起宿主反應、基因和免疫影響三者相互作用的結(jié)果，其病程漫長，常反復發(fā)作，而TNBS/乙醇溶液灌腸模型和乙酸灌腸等模型僅利用理化因素直接刺激，造成腸黏膜及血管損傷，其病程維持時間短，且與臨床病因病機及疾病過程差異較大。因此，探討UC發(fā)病的病因病機，建立系統(tǒng)合理的中醫(yī)評價體系，尋找特異性指標已刻不容緩。

綜上所述，束縛法對大鼠情志的影響已有較多人研究證實，其配合飲食失節(jié)刺激，所制成的肝郁脾虛證型模型相較于其他方法有更多的理論和實驗依據(jù)。免疫復合法模型體現(xiàn)了腸道黏膜損害與免疫失調(diào)這兩個與人UC相似度極高的病理特征，造模后病程持續(xù)時間較長。筆者認為，束縛法結(jié)合飲食失節(jié)法結(jié)合免疫復合法是現(xiàn)階段一種較為符合肝郁脾虛型UC病理特征的造模方法。隨著科技的進步和對中醫(yī)病因病機學更深入的探索，對UC基因、免疫等更深入的研究將為建立理想的UC模型奠定基礎(chǔ)，為解決UC這一世界難治病提供更好的條件。