納米顆粒在獸用疫苗中的應(yīng)用

程志萍

（四川省水產(chǎn)學(xué)校 四川成都 611730）

1 前言

當(dāng)今各類傳染性疾病嚴(yán)重威脅著人類和動物的健康，在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫是預(yù)防疾病最行之有效的措施。18 世紀(jì)后期，英國醫(yī)生琴納應(yīng)用牛痘預(yù)防天花，發(fā)明了第一代疫苗：滅活疫苗和減毒疫苗。隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了如亞單位疫苗、多肽疫苗和脫氧核糖核酸（DNA）疫苗的第二、三代疫苗。然而，這些疫苗存在免疫原性弱、免疫劑量大、免疫持久性差及易降解等缺點。納米顆粒具有靶向遞送的作用，可維持抗原穩(wěn)定性，增強機體先天免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，得到了疫苗研發(fā)者的青睞。本文綜述了新型納米佐劑的性質(zhì)、作用特點及其在獸用疫苗中的應(yīng)用。

2 納米顆粒特性

2.1 納米材料

納米顆粒（Nanoparticles，NP）是指粒徑為納米級（10-9m）的固體膠體顆粒。納米顆?？梢杂山饘?、非金屬、合成聚合物或天然聚合物等多種類型材料形成。納米材料具有的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)，使其具有了特殊性能。

2.2 納米粒子的性質(zhì)

納米顆?？赏ㄟ^沉淀法、溶膠-凝膠法、單乳液溶劑蒸發(fā)法、乳化溶劑擴散法、聚電解質(zhì)復(fù)合物或自組裝聚電解質(zhì)等方法制備[1]?？乖肿涌梢耘c納米載體表面共軛、包封或表面吸附。在制備過程中可通過改變納米顆粒物理化學(xué)性質(zhì)，如大小、形狀、電荷、表面積和疏水性等性質(zhì)來對納米材料進行工程改造，以增強疫苗的免疫效果。

2.2.1 納米顆粒對細(xì)胞吸收的影響

粒徑是影響免疫系統(tǒng)攝取NP 的關(guān)鍵因素之一，可以通過細(xì)胞吞噬作用和胞飲作用內(nèi)吞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DC）可吞噬大于500 nm的NP，網(wǎng)格蛋白攝取小于150 nm 的NP，小凹蛋白介導(dǎo)的胞飲作用攝取 50～80 nm 的 NP[2]。NP 除了通過內(nèi)吞機制侵入細(xì)胞外，還可以直接穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞[3]。20～50 nm 的顆粒適合通過淋巴管運輸?shù)竭_(dá)淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)中被抗原提呈細(xì)胞（Antigen Presenting Cell，APC）內(nèi)化，500～2 000 nm 的大顆粒需要通過 APC將細(xì)胞轉(zhuǎn)運到淋巴結(jié)[4]。

2.2.2 納米顆粒粒徑對免疫應(yīng)答類型的影響

不同大小的納米顆粒載體結(jié)合的抗原會影響淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)運和特異性細(xì)胞相互作用。Stano 等[5]發(fā)現(xiàn)將NP 的大小從30nm 增加到200nm，卵清蛋白（OVA）可以更有效地傳遞到MHC I 類和MHC II 類演示路徑中。使用 200 nm NP 的鼻黏膜免疫增加了肺部T 輔助（CD4+T）細(xì)胞反應(yīng)以及全身和黏膜反應(yīng)。50～100 nm大小的納米顆粒比5～15 nm 納米粒子產(chǎn)生的特異性抗體高5 倍[6]。

2.2.3 納米顆粒大小及給藥途徑對分布的影響

NP 的生物分布取決于給藥途徑和大小。納米顆粒經(jīng)口服、鼻和眼輸送可提供黏膜保護性免疫反應(yīng)，納米粒子能被黏膜相關(guān)淋巴組織中的M 細(xì)胞（MALT）吸收，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)[7]。皮內(nèi)注射后，間隙流將超小納米顆粒（25 nm）高效地轉(zhuǎn)運到淋巴毛細(xì)血管及其引流淋巴結(jié)中，靶向50%的淋巴結(jié)駐留樹突狀細(xì)胞，而100 nm 納米顆粒的效率僅為10%[8]。

2.2.4 納米顆粒形狀對吸收分布及免疫類型的影響

有研究報道了納米粒子的形狀依賴分布，短桿二氧化硅納米粒子（MSN）主要分布在肝臟，長桿MSN分布在脾臟[9]。MSN 經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾后在肺中的含量更高。MSN 主要通過尿液和糞便排出，MSN的清除率主要取決于顆粒形狀，短桿MSN的清除率比長桿更快。棒狀金納米顆粒（AuNPs）比球形AuNPs或立方AuNPs 更易被巨噬細(xì)胞和骨髓源性樹突狀細(xì)胞（BMDCs）攝取。小的球形顆粒（直徑193 nm）產(chǎn)生偏向Th1 的反應(yīng)，而棒狀顆粒（長度1 530 nm）產(chǎn)生偏于 Th2 的反應(yīng)[10]。

2.2.5 納米顆粒表面性質(zhì)對細(xì)胞吸收的影響

NP 表面性質(zhì)如電荷和疏水性會影響其吸收，細(xì)胞膜帶負(fù)電，因此陽離子顆粒更易被APC 吸收，通過DC 到淋巴結(jié)。細(xì)胞攝取速率和數(shù)量均與表面電荷呈正相關(guān)，帶正電荷的NP 被內(nèi)化后可在核周定位，而帶負(fù)電荷和中性的NP 則傾向于與溶酶體共定位[11]。具有高表面電荷和大粒徑的NP 被更易被巨噬細(xì)胞吞噬，帶輕微負(fù)電荷且粒徑為150 nm 的NP傾向于更有效地積累在腫瘤中[12]。帶正電荷的NP 經(jīng)肺給藥后引起強烈的黏膜和全身抗體反應(yīng)，而帶負(fù)電荷的NP 則不能[13]。疏水性聚合物顆粒的免疫反應(yīng)優(yōu)于親水性聚合物[14]。

2.2.6 納米顆粒性質(zhì)對抗原釋放速率的影響

納米顆粒的抗原的釋放取決于多種因素，如大小、納米聚合物組成、基質(zhì)的孔隙率、抗原載量或與納米顆粒的結(jié)合方式等。如抗原被包裹，抗原的釋放取決于納米粒的降解，侵蝕或溶解，只有在納米載體部分或完全解離后才緩慢釋放抗原，從而導(dǎo)致較低的釋放速率。如果抗原吸附在納米粒表面，則取決于納米粒與抗原之間的相互作用，吸附可能導(dǎo)致抗原大量突釋；且納米粒越小，表面積相對越大，表面附近的抗原比例就越大，抗原釋放的速度就越快，可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)不足。

3 納米顆粒在獸用疫苗中的應(yīng)用

3.1 病毒樣顆粒佐劑

病毒樣顆粒（Virus-Like Particles，VLPs）是病毒結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建的，缺乏傳染性核酸而具有非感染性，通過生物相容性衣殼蛋白的自組裝形成。VLP 模仿病毒體，可以有效誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[15]。

口蹄疫病毒（FMDV）3A 蛋白的T 抗原決定簇嵌合于兔出血癥病毒（RHDV）的 VLP（RHDV-3A-VLP），在體外可激活未成熟的豬小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（BMDC）。經(jīng)鼻內(nèi)或肌內(nèi)接種后可誘導(dǎo)特異性IgG和IgA 抗體，如肌內(nèi)接種加上MontanideTMISA 206佐劑后，其抗體水平更高，明顯增加分泌IFN-γ 的細(xì)胞數(shù)量和針對3A 表位和RHDV-VLP 的淋巴增生[16]。表達(dá) FMDV 衣殼蛋白（VP0，VP1 和 VP3）的 FMDVVLP，肌注豚鼠，豬和牛，刺激了機體FMDV 特異性抗體應(yīng)答，中和抗體應(yīng)答，T 細(xì)胞增殖應(yīng)答和IFN-γ的分泌[17]。重組 FMDV 衣殼蛋白VP1 組裝的 VLP，也誘導(dǎo)了較高水平的FMDV 特異性體液反應(yīng)和T 細(xì)胞增殖[18]，F(xiàn)MDV-VLP 還可與二氧化硅納米粒子一起免疫，具有免疫增強的作用[19]。

大腸桿菌表達(dá)的重組Ⅱ型豬圓環(huán)病毒（PCV2）Cap 蛋白自組裝成均質(zhì)圓形VLP，免疫3 周齡仔豬，可保護對 PCV2 強度的攻擊[20]。Li 等[21]將生長抑素（SS）基因融合到PCV2，構(gòu)建了重組桿狀病毒（rAc-Cap-SS），接種動物后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對 PCV2 和 SS 特異性抗體，相對日增重高于其他對照組。Zhang 等[22]構(gòu)建的重組桿狀病毒Ac-Cap-GM-CSF，表達(dá)蛋白后自組裝成直徑17～25 nm 的VLP，免疫豬后，能提高PCV2 特異性抗體和中和抗體水平。

有報道用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒表面蛋白GP5-GP4-GP3-GP2a-M 或 GP5-M 產(chǎn)生了 PRRS 病毒樣顆粒（PRRS-VLP），然后將 PRRS-VLP 包裹在 PLGA納米顆粒中，與強效佐劑鼻內(nèi)給藥。結(jié)果表明，PRRS-VLPs 引起記憶缺失的免疫反應(yīng)，接種疫苗和病毒攻擊的動物中IgG 和IFN-γ 產(chǎn)生增強，但在攻擊前階段卻沒有。且在接種PRRS-VLP 的動物中，肺病毒滴度降低了 2 個對數(shù)[23]。另有報道，用 PBS、PRRSV VLP 或 PRRSV VLP 加 2’，3’-cGAMP 佐劑鼻內(nèi)免疫動物，強度攻擊動物，所有動物都檢測到PRRSV N 蛋白特異性抗體，但接種組和對照組之間未見顯著差異。且在VLP 和VLP 加上佐劑組中觀察到明顯更高的病毒血癥[24]。由此看來，基于 VLP 的PRRSV 疫苗還需進一步研究評估。

另有報道，豬細(xì)小病毒PPV-VLP 疫苗，與礦物質(zhì)油包水佐劑共免疫母豬，產(chǎn)生了高滴度血清抗體。當(dāng)用強毒株攻擊胎兒，能夠取得完全保護[25]。流感病毒 H1N1 的 HA，NA 和 M1 蛋白的相關(guān) VLP，肌注豬后，能誘導(dǎo)較強的血清IgG，黏膜IgA 和病毒中和抗體反應(yīng)，且抑制了上下呼吸道的病毒，減少了肺炎病變[26]。豬腦心肌炎病毒（EMCV）VLP 疫苗免疫后，產(chǎn)生了高水平的中和抗體，且注射部位無嚴(yán)重反應(yīng)[27]。

3.2 PLGA 納米佐劑

聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（Lactic-co-Glycolic Acid），PLGA]是乳酸和羥基乙酸的聚合物，可以用不同比例的乳酸和羥基乙酸聚合成各種分子量和端基類型（酯封端或羧酸封端）。PLGA 由于酯鍵斷裂而降解，最終水解成原始的單體乳酸和羥基乙酸，它們是各種代謝途徑的副產(chǎn)物，沒有明顯的毒性。分子量低、親水性高和結(jié)晶度低的PLGA 分子降解得更快。PLGA 納米顆?？赏ㄟ^模仿入侵病原體的大小和形狀來增加攝取和交叉呈遞。有研究將PLGA 納米顆粒封裝蛋白質(zhì)抗原，并與激動劑TLR3 和TLR7 配體一起免疫，可有效地靶向DC 并被DC 內(nèi)吞，促進細(xì)胞免疫和體液免疫[28]。

PLGA 納米顆粒封裝的PRRSV 滅活疫苗（NPKAg），經(jīng)鼻免疫后，豬肺勻漿和血清具有更高的IFN-γ 水平和更低的TGF-β 水平，激發(fā)了先天免疫和適應(yīng)性免疫。當(dāng) NP-KAg 與結(jié)核分枝桿菌全細(xì)胞裂解液一起經(jīng)鼻免疫后，可提高IgA、IgG1 和IgG2抗體水平，平衡 Th1-Th2 反應(yīng)，IFN-γ 和淋巴細(xì)胞亞群的頻率增加[29，30]，引起了廣泛的交叉保護性免疫應(yīng)答，顯示出這種創(chuàng)新的疫苗接種策略可防止豬PRRS 爆發(fā)?？刂剖秤脛游锖腿祟愔衅渌粑兰膊〉念愃品椒磥硎强尚械?。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）滅活抗原（KAg）的 PLGA 納米顆粒（PLGA-KAg），免疫的妊娠母豬后，PEDV 特異性IgG 和IgA 抗體滴度顯著提高。配合MontanideTMISA 201 VG佐劑使用后，誘導(dǎo)了更好的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IFN-γ 水平，且對仔豬有保護作用[31]。豬流感病毒（SwIV）H1N2 抗原（KAg）的 PLGA 納米顆粒（PLGA-KAg），經(jīng)鼻免疫后，增加了抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖，增強了外周血單核細(xì)胞（PBMC）中T 輔助/記憶和CTL的頻率，并降低了豬氣道中挑戰(zhàn)的異源病毒載量，但抗體水平未見提高[32，33]。

3.3 殼聚糖納米佐劑

殼聚糖（Chitosan，CS）是由甲殼素（例如，蟹，蝦和小龍蝦）的主要成分甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酰作用而得到，化學(xué)結(jié)構(gòu)為帶陽離子的高分子堿性多糖聚合物，脫乙?；潭瓤捎绊懫浞肿恿?、電荷密度和溶解度等，使其具有獨特的理化性能和生物學(xué)功能。殼聚糖可以激活樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)DC 成熟和分泌細(xì)胞因子。

殼聚糖納米顆粒（CNP）包埋的豬IL-2 和IL-4/IL-6 作為PCV-2 疫苗佐劑，可促進豬特異性免疫應(yīng)答[34]。殼聚糖/海藻酸鈉納米顆粒包封的BV（CH/ALBV），作為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）疫苗佐劑，經(jīng)鼻免疫，可以有效誘導(dǎo)Th1 相關(guān)的免疫反應(yīng)，激活CD4+T 淋巴細(xì)胞，增加細(xì)胞因子（IFN-γ 和 IL-12）和轉(zhuǎn)錄因子（STAT4 和 T-bet），還刺激 IFN-γ 分泌細(xì)胞家族[35]。將滅活的豬甲型流感 H1N2 抗原（KAg）封裝在CNP 中，經(jīng)噴霧免疫，顯示增強細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫反應(yīng)[36]。CNP 很有潛力作為黏膜疫苗佐劑。

3.4 其他納米佐劑

有研究表明，氫氧化鋁NP 用做高致病性禽流感病毒HPAIV（H5N1）的免疫佐劑，提高了其抗體水平，降低了佐劑的副作用[37]。脂質(zhì)體NP 封裝流感病毒肽段后，與佐劑共免疫，增強了黏膜免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)特異性T 輔助/記憶細(xì)胞以及IFN-γ 應(yīng)答，減輕了臨床癥狀[38]。磷酸鈣納米顆粒偶聯(lián)新城疫（NDV）疫苗引起更強和更長的免疫反應(yīng)，且雞血清鈣和磷水平未見升高[39]。金納米顆粒與 CpG[40]、殼聚糖[41]佐劑聯(lián)合使用，與流感、破傷風(fēng)類毒素經(jīng)鼻或口服方式給藥，激活了局部免疫反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)。

4 結(jié)論

納米顆粒應(yīng)用于疫苗，具有載體兼佐劑的作用，其促進免疫原性的機制主要為：促進DC 的吸收，抗原緩釋，靶向呈遞，交叉呈遞，增強抗原的穩(wěn)定性等?？梢酝ㄟ^基因工程技術(shù)構(gòu)建多價苗和多聯(lián)苗，還可將多種納米顆粒融合使用，多種途徑進行免疫，以激發(fā)更全面的免疫反應(yīng)。納米顆粒大小、形狀、表面電荷、疏水性、孔隙率和結(jié)晶性等特性對納米佐劑的內(nèi)吞、釋放及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等方面有較大的影響。在應(yīng)用中，如何控制納米粒的大小、形狀、均一性，減小體內(nèi)環(huán)境對納米粒的影響，以何種方式合成和化學(xué)修飾納米材料，減小毒性，以合理的途徑進行代謝，并減小對環(huán)境的污染等問題，還需要人們進行大量的研究，以開發(fā)出更加安全、有效、實用的新型納米顆粒，為疫苗研發(fā)提供潛能。