生物樣品中兒茶酚胺的分析方法研究進(jìn)展*

周 慧，董 佳，賀茂芳,2**，劉文杰，程清軒，何孝文

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

兒茶酚胺(Catecholamines，CAs)類(lèi)物質(zhì)主要包括去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、腎上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Dopamine，DA)[1]。CAs既是神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)，也是內(nèi)分泌激素，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。臨床上，可通過(guò)檢測(cè)人體中血漿或尿液中CAs的濃度水平用于診斷高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌相關(guān)的疾病[2-3]。因此，建立選擇性好、靈敏度高、快速準(zhǔn)確的分析方法具有重要意義。目前，測(cè)定CAs的方法有高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、電化學(xué)法和熒光光度法(FL)等。作者就近年來(lái)CAs的測(cè)定方法進(jìn)行了評(píng)述，將為發(fā)展CAs的檢測(cè)新方法提供參考依據(jù)。

1 HPLC法

HPLC法由于具有方便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是CAs最常用的分析方法。由于CAs分子中的氫鍵易于和硅醇基形成氫鍵，從而造成不可逆吸附，因此通常向流動(dòng)相中加入酸改善峰型；或者向流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，如十八烷基磺酸鈉，采用離子對(duì)色譜進(jìn)行分離。HPLC法常與電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)、熒光檢測(cè)器(FLD)、質(zhì)譜(MS)等聯(lián)用，以提高靈敏度[4]，ECD因其高靈敏度、高分離效率成為首選。

1.1 HPLC-ECD

李靜娜等[5]建立了HPLC-ECD法測(cè)定人體血清中的CAs，首先采用氧化鋁作為固相萃取材料對(duì)CAs進(jìn)行預(yù)富集，再運(yùn)用HPLC-ECD檢測(cè)，獲得最低檢出限為0.1 ng/mL。該方法操作簡(jiǎn)單，所需生物樣本少，同時(shí)，還具有靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好的優(yōu)點(diǎn)。

于夢(mèng)洋等[6]應(yīng)用HPLC-ECD檢測(cè)大鼠血清中的E、NE以及DA的含量，研究了束縛擠壓傷大鼠血清中CAs的變化。結(jié)果顯示，E、NE及DA的分離效果良好，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，各物質(zhì)的回收率分別為98.54%、99.21%和97.31%。

張文等[7]以摻鈰納米二氧化鉛修飾電極作為HPLC的檢測(cè)器，建立了人體腦脊液中DA等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定方法。該修飾電極具有良好的電催化作用，獲得了較高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性。

曾文芳等[8]采用離子色譜分離、碳納米管修飾電極檢測(cè)，以c(硫酸)=10 mmol/L-φ(乙腈)=10%溶液為流動(dòng)相測(cè)定CAs。該方法的檢出限為0.04～0.09 ng/mL，回收率為96%～102%，具有準(zhǔn)確度高、精密度好的特點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)單快速的分析方法。

吳朝陽(yáng)[9]等人為減少血漿用量、提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，采用弱陽(yáng)離子固相萃取小柱聯(lián)合HPLC-ECD法提取并檢測(cè)人體血漿中的CAs。該方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度好、操作簡(jiǎn)便，適合于臨床診療的需要。

Tolmacheva等[10]采用超交聯(lián)聚苯乙烯進(jìn)行預(yù)富集，聯(lián)合HPLC-FLD法檢測(cè)CAs，優(yōu)化了NE、DA和E的預(yù)富集條件為微柱(10 mm×6 mm)、吸附劑質(zhì)量0.03 g、溶液體積25 mL(pH≈8.5)，溶液透過(guò)率1.0 mL/min。將該方法應(yīng)用于尿液中CAs的分析檢測(cè)，準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好。

1.2 HPLC-FLD

鄧祖躍等[11]采用HPLC-FLD法測(cè)定了不同腦區(qū)CAs及其代謝產(chǎn)物的含量，作者優(yōu)化色譜條件，建立了新的梯度洗脫系統(tǒng)，既可以檢測(cè)常見(jiàn)的3種CAs，也可以檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的代謝物。該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、分離度高、重復(fù)性好，適用于一般實(shí)驗(yàn)室腦組織中CAs及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定。

張璐璐等[12]采用HPLC-FLD法研究了小鼠腦皮層、丘腦等不同部位的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)。樣本經(jīng)高氯酸沉淀蛋白后進(jìn)行色譜分析，7種目標(biāo)物在45 min內(nèi)完全分離，并且樣本基質(zhì)無(wú)干擾。該方法鑒別出小鼠腦中存在NE、DA和E等物質(zhì)，結(jié)果準(zhǔn)確，同時(shí)提取回收率大于90%。

喬坤云等[13]采用HPLC-FLD法檢測(cè)CAs，可同時(shí)分離測(cè)定NE、DA和E 3種組分。該方法的前處理簡(jiǎn)單易操作，同時(shí)也具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。

1.3 HPLC-MS

HPLC-MS法能夠高效、高靈敏度分離和檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)，但為了提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和選擇性，通常需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程[14]。

郭玲等[15]利用HPLC-MS法對(duì)大鼠血漿中的DA、E以及NE等7種神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行了快速有效檢測(cè)。首先采用Waters XSelect@HSS PFP色譜柱進(jìn)行分離，然后以乙腈-φ(甲酸)=0.1%和水-φ(甲酸)=0.1%溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件，避免了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了方法的準(zhǔn)確度。

丘秀珍等[16]運(yùn)用DA作為模板，多孔的陽(yáng)極氧化鋁膜為反應(yīng)載體，合成了DA印跡聚合物納米管膜，通過(guò)HPLC法研究了其對(duì)CAs的吸附性能。結(jié)果顯示，在最優(yōu)萃取條件下，DA印跡聚合物納米管膜對(duì)NE、DA和E均具有較好的選擇性，該方法能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出人尿液中CAs的含量。

亓偉梅等[17]通過(guò)建立超高液相色譜(UHPLC)-MS/MS法，實(shí)現(xiàn)了微量大鼠腦微透析液中3種CAs的高靈敏檢測(cè)。該方法可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出3種組分，能夠滿(mǎn)足大鼠腦微透析液中CAs的檢測(cè)要求，具有一定的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

黃鑫等[18]采用HPLC-MS法檢測(cè)大鼠和海馬大腦皮層中生物胺及氨基酸類(lèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量，比較了不同腦組織樣品前處理方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可為CAs提供有效的樣品前處理方法和檢測(cè)手段。

2 電化學(xué)法

CAs在電極表面呈現(xiàn)不同的電化學(xué)行為，因而具有不同的氧化峰電流和電極電位，從而可使用電化學(xué)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)階段，電化學(xué)法檢測(cè)CAs的主要方法為化學(xué)修飾電極法，該方法將聚合物膜修飾在電極表面從而提高電極電催化性能。鄧克勤等[19]通過(guò)電聚合法制備了硫堇膜修飾電極，研究了CAs在該電極上的電化學(xué)行為，與裸玻碳電極相比，氫化峰電流增大且峰電位負(fù)移至165 mV。該電極的重現(xiàn)性較好，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAs和氫醌的同時(shí)測(cè)定。R Ramaraj研究小組[20]采用聚吖嗪和聚酚藏花紅膜玻碳修飾電極，同時(shí)測(cè)定了DA和抗壞血酸，其線(xiàn)性范圍分別為5.0×10-5～5.0×10-4mol/L和5.0×10-5～1.0×10-3mol/L。Yi等[21]首次報(bào)道了聚乙烯醇縮丁醛/氧化石墨烯(PVB/GO)納米復(fù)合膜電化學(xué)傳感器用于CAs代謝產(chǎn)物的同時(shí)測(cè)定。PVB/GO修飾玻碳電極對(duì)高香草酸和香草醛扁桃酸的氧化具有良好的親和性和電催化活性，差分脈沖伏安法顯示這2種代謝物在修飾電極上的峰電位幾乎一致。研究者從線(xiàn)性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率等方面對(duì)傳感器的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明該傳感器具有成本低、穩(wěn)定性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

為了提高分析的選擇性，Kajisa等[22]以DA為模板，在場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FET)生物傳感器的Au柵電極上合成了分子印跡聚合物(MIP)，該電極在40 nmol/L～20 μmol/L對(duì)DA有顯著的響應(yīng)，而非印跡聚合物涂層的FET柵極表面電位幾乎沒(méi)有變化，證實(shí)了DA-MIP涂層FET傳感器對(duì)DA的選擇性和定量檢測(cè)。

納米材料具有特殊的物理性能、優(yōu)異的光電化學(xué)性質(zhì)，將納米材料用于電極的表面修飾能有效提高電極的催化性能，提高選擇性和靈敏度。例如，謝云峰等[23]將羧基化多壁碳納米管(MWNTs)修飾在玻碳電極表面，用于DA和5-HT的研究，發(fā)現(xiàn)羧基化MWNTs修飾電極對(duì)DA和5-HT具有顯著的電催化作用，可用于這2種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定。

3 CE法

CE是一種高效的分離技術(shù)，在藥物分析、體液成分的分離與分析等方面具有廣泛的應(yīng)用，具有樣品用量少、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。CE法依據(jù)待分離物質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，由于分析物易于和毛細(xì)管壁作用，所以通常需要對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行修飾，從而實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，確保重現(xiàn)性。CE通常與化學(xué)發(fā)光法(CL)、MS、紫外檢測(cè)器(UV)等聯(lián)用，用于CAs的檢測(cè)。

3.1 CE-CL法

張東明等[24]建立了用半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)熒光結(jié)合CE測(cè)定NE和DA的分析方法，考察了青色素衍生物(Cy5)對(duì)NE和DA的各種衍生條件。在優(yōu)化條件下，NE和DA在3×10-8～5×10-6mol/L內(nèi)與其熒光強(qiáng)度呈線(xiàn)性關(guān)系。NE和DA的最低檢測(cè)濃度分別為5.9×10-9、5.4×10-9mol/L。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、靈敏、樣品用量少，適合于痕量單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的分析。

徐向東等[25]基于堿性介質(zhì)中CAs對(duì)魯米諾-Ag(Ⅲ)化學(xué)發(fā)光體系有增敏作用的原理，建立了CE-CL法檢測(cè)DA、E與NE的新方法。在優(yōu)化的電泳和化學(xué)發(fā)光條件下，DA、E與NE可獲得良好分離，其檢出限(S/N=3)分別為10、100、200 ng/mL。

李欣欣等[26]基于堿性條件下CAs淬滅鐵氰化鉀-魯米諾發(fā)光的原理，建立了CE-CL技術(shù)分離測(cè)定3種CAs的方法。在最佳條件下，測(cè)得DA、E、NE的檢出限分別為50.49、329.76、406.03 ng/mL。該方法采用的間接化學(xué)發(fā)光法是基于酚類(lèi)物質(zhì)與鐵氰化鉀之間的氧化還原原理，因此，生物樣品中的蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類(lèi)等無(wú)還原性的物質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)，從而大大提高了選擇性。

3.2 CE-MS

王賢親等[27]采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱，以乙腈-φ(甲酸)=0.1%溶液為流動(dòng)相，電噴霧離子源(ESI)正離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式對(duì)樣本進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，E、NE和DA的檢出限分別為4.3、2.4和6.6 ng/mL，線(xiàn)性范圍為10～500 ng/mL，平均回收率為85.8%～93.4%。該方法的專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏好、準(zhǔn)確高，適用于人血漿CAs的快速檢測(cè)。

3.3 CE-紫外光譜法(UV)

付敏等[28]建立了高效毛細(xì)管電泳結(jié)合UV檢測(cè)DA和5-HT的方法，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，DA、3,4-二羥芐胺和5-HT在10 min內(nèi)得到很好的分離，檢出限分別為3.09×103、1.42×103、2.11×103ng/mL，該法簡(jiǎn)便快速、樣品用量少、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

3.4 其他

張麗瑤等[29]研究了毛細(xì)管預(yù)處理方法對(duì)組胺、5-HT及CAs電泳分離的影響，采用優(yōu)化的毛細(xì)管預(yù)處理方法及電泳分離條件，基線(xiàn)分離了組胺、5-HT、NE和E。利用DA和5-HT在毛細(xì)管內(nèi)壁吸附效應(yīng)的不同，對(duì)電泳淌度極為相近的DA和5-HT進(jìn)行了分離和鑒定。以小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，證實(shí)了該細(xì)胞中所含大量神經(jīng)遞質(zhì)為DA，而不是5-HT。

林玲等[30]基于CE法建立了兒茶酚及DA的主要代謝產(chǎn)物二羥苯乙酸(DopAC)的定量分析，靈敏度可達(dá)5×10-9g/mL，線(xiàn)性范圍為0.01～0.32 μg/mL。該方法用于兒茶酚和DopAC的分析具有快速、簡(jiǎn)便、耗材少的優(yōu)點(diǎn)。

高萍等[31]采用CE法檢測(cè)了46例正常人以及11例嗜鉻細(xì)胞瘤患者尿中NE、間甲腎上腺素(MN)、間去甲腎上腺素(NMN)和3-甲氧基-4-羥基苦杏仁酸(VMA)的含量。結(jié)果顯示，NMN和MN聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率為100%，假陽(yáng)性率為19.56%。因此，CE法對(duì)NMN和MN聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于診斷嗜鉻細(xì)胞瘤有意義。

4 光譜法

光譜法是基于物質(zhì)與輻射能作用時(shí)，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級(jí)躍遷而產(chǎn)生發(fā)射、吸收或散射的波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。

4.1 熒光法

胡紅美等[32]提出了用芯片電泳分離-激光誘導(dǎo)熒光光譜法測(cè)定CAs的方法。采用自制的無(wú)泵負(fù)壓進(jìn)樣系統(tǒng)，避免了進(jìn)樣歧視效應(yīng)。在優(yōu)化的條件下，NE、DA和E可在1 min內(nèi)完全分離。3種CAs的平均遷移時(shí)間依次為30.59、37.23、46.43 s，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)依次為1.10%、1.28%、0.45%，線(xiàn)性范圍為0.3～5.0 mg/L(NE及DA)和0.05～4.0 mg/L(E)，檢出限依次為30、30、10 ng/mL。

Nikolajsen等[33]利用E和NE光譜之間的差異，通過(guò)鐵氰化鉀氧化CAs生成相應(yīng)的三羥基吲哚類(lèi)物質(zhì)，利用硫酸鋅為催化劑，抗壞血酸為穩(wěn)定劑來(lái)提高其熒光強(qiáng)度，所得數(shù)據(jù)用兩組分四列并行因子分析模型同步測(cè)定E和NE，檢測(cè)靈敏度可達(dá)7.5×10-8mol/L。

趙燕燕等[34]將膠束增敏與同步熒光-雙波長(zhǎng)法用于血漿樣品中CAs的同時(shí)測(cè)定，取得了良好的結(jié)果。發(fā)射波長(zhǎng)(λem)在370.0～550.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和λem的波長(zhǎng)差為70.0 nm的條件下分別進(jìn)行掃描，獲得同步熒光光譜圖，在385.0 nm處直接讀出DA的熒光強(qiáng)度。

Palop等[35]報(bào)道了利用水中的溶解O2氧化E，在堿性條件下最終形成腎上腺素黃，然后通過(guò)流動(dòng)注射-FL法檢測(cè)450 nm處的吸收峰，結(jié)果顯示，對(duì)E檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為0.5～20 μg/mL，檢出限為2.0×102ng/mL。

4.2 分光光度法

Nagaraja等[36]報(bào)道了重氮硝基苯胺(DPNA)在酸性條件下與CAs的衍生物反應(yīng)，所產(chǎn)生的紅色復(fù)合物在500～510 nm處有強(qiáng)吸收峰，由此得出E的檢出限為1.47×102ng/mL。

Teixeira等[37]用固定在聚酯樹(shù)脂上的PbO2作為固相反應(yīng)器氧化E得到的腎上腺素紅，然后在486 nm處用流動(dòng)注射分光光度法檢測(cè)吸收峰，結(jié)果顯示E在1×10-4～8×10-4mol/L內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為1.47×103ng/mL。

Abdulrahman等[38]用p-甲苯胺在高碘酸鈉的氧化作用下和E形成橙色的可溶性產(chǎn)物，該產(chǎn)物在480 nm處有最大吸收峰，可用流注射分光光度法檢測(cè)，檢測(cè)下限為6.78×102ng/mL，線(xiàn)性范圍為2.7×10-5～3.7×10-4mol/L。

5 結(jié)束語(yǔ)

CAs作為生物體內(nèi)重要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和同時(shí)檢測(cè)具有重要意義。目前，CAs的檢測(cè)方法有很多，各有優(yōu)勢(shì)，相互補(bǔ)充，為CAs的檢測(cè)提供了多種途徑。其中，HPLC、EC和電化學(xué)法是最有效的方法，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為生物樣品中CAs的準(zhǔn)確測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。