鼻用葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠劑的制備與質(zhì)量評價*

陳 函，廉 婷,2，杜遠東，陳 程**，馬 寶

(1.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.陜西省呼吸病預防及診治工程研究中心，陜西 西安 710021；3.漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000)

葛根素(Puerarin)是從豆科植物野葛的干燥根中得到的一種黃酮類化合物，化學名為8-β-D葡萄吡喃糖-4′,7二羥基異黃酮[1]。葛根素具有較為廣泛的藥理活性，包括降血糖、降血脂、增強免疫力、抗氧化、抗血小板聚集、擴張冠狀動脈和腦血管等[2-4]。目前臨床葛根素注射液常用于輔助治療腦血管疾病[5-8]，但藥動學和組織分布研究表明[9]，注射給藥后在腦部分布很少，亟待研究一種新型給藥途徑。藥物經(jīng)鼻黏膜給藥，具有吸收迅速、生物利用度高、避免肝臟首過效應等優(yōu)勢，且鼻腔與腦存在生理上獨特的聯(lián)系使其能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)性遞藥入腦，即腦靶向性好，因此鼻腔給藥已成為中樞系統(tǒng)疾病的理想給藥途徑[10]。近幾年，脂質(zhì)體溫敏凝膠應用于黏膜給藥的研究報道較多[11-14]，其兼具脂質(zhì)體和凝膠劑雙重特性，優(yōu)勢在于藥物包封于紙質(zhì)雙分子層內(nèi)，避免凝膠突釋現(xiàn)象，雙重緩釋特性，且穩(wěn)定性提高，溫敏性凝膠的相變特征使其黏附于鼻黏膜，提高藥物滯留時間?；诖?，作者以葛根素為研究對象，將其制備成鼻用脂質(zhì)體溫敏凝膠并評價其質(zhì)量，為葛根素新型制劑開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

葛根素：批號201812011，純度>98%，西安灃禾生物科技有限公司；葛根素對照品：批號S02M9B54875，純度≥98%，大豆卵磷脂：批號T30M10F84483，膽固醇：批號L27J9F66501，硫酸魚精蛋白：批號Z05M9H54987，上海源葉生物有限公司。

其他試劑：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀：1260，美國Agilent公司；黏度計：SNB-1，上海方瑞儀器有限公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN-3600，英國馬爾文儀器有限公司；pH計：STARTER2100，奧豪斯儀器有限公司；電子天平：BT125D，賽多利斯科學儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：SB-5200DT，寧波新芝生物科技有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC定量分析

采用HPLC法，色譜柱：Agilent HC-C18柱(250 mm×4.6 nm，5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(水)=25∶75；檢測波長為250 nm；柱溫為(30±0.5)℃；進樣量10 μL；流速1 mL/min。

稱取葛根素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、1.0、2.0、5.0、20.0 μg/mL的溶液，分別按照上述色譜條件方法進樣分析，以峰面積(A)為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸。

1.2.2 供試品溶液、空白供試品溶液的配制

精密移取葛根素脂質(zhì)體1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲破囊，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。除不加藥外，在相同條件下得空白供試品溶液，備用。

1.2.3 脂質(zhì)體包封率和載藥量測定

在文獻[15]和預實驗結(jié)果基礎上，選擇魚精蛋白凝聚法測定葛根素脂質(zhì)體的包封率，具體操作為精密移取0.1 mL脂質(zhì)體溶液，加入ρ(魚精蛋白)=10 mg/mL的溶液0.2 mL，攪勻，再加生理鹽水2 mL，n=3 500 r/min,高速離心15 min，精密移取上清液0.8 mL于1 mL生理鹽水中，再加甲醇稀釋至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按照色譜條件進樣分析。另取0.1 mL脂質(zhì)體溶液，加入50倍甲醇進行超聲破囊，然后按照色譜條件進樣分析。按照公式(1)和(2)計算脂質(zhì)體包封率和載藥量。

(1)

(2)

式中：mt為投入葛根素質(zhì)量，mg；md為未包封進入脂質(zhì)體(游離)葛根素質(zhì)量，mg；mw為載藥脂質(zhì)體總質(zhì)量，mg。

1.2.4 葛根素脂質(zhì)體制備工藝篩選

(1)薄膜分散法

精密稱取葛根素0.08 g、卵磷脂0.80 g、膽固醇0.20 g，溶于60 mL無水乙醇中，置于茄形瓶中35 ℃恒溫水浴減壓蒸餾除去乙醇，形成均勻透明的薄膜，將磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.0)30 mL緩慢注入茄形瓶中旋轉(zhuǎn)水合60 min，轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，于250 W、34 kHz條件下冰浴超聲15 min，得到乳狀半透明脂質(zhì)體溶液，4 ℃下密封保存，備用。

(2)逆向蒸發(fā)法

稱取卵磷脂0.80 g、膽固醇0.20 g，加入56 mL三氯甲烷和4 mL異丙醇超聲溶解，作為油相；稱取葛根素0.08 g加入PBS(pH=7.0)溶解并定容至10 mL，作為水相；將水相緩慢加入油相中并超聲(60 ℃、90 min)乳化，再減壓除去有機溶劑，滴加PBS(pH=7.0)30 mL水化，繼續(xù)減壓蒸發(fā)，再超聲處理15 min，得到乳狀半透明脂質(zhì)體溶液，4 ℃下密封保存，備用。

(3)乙醇注入法

稱取卵磷脂0.80 g、膽固醇0.20 g，用無水乙醇15 mL充分溶解，作為油相；稱取0.08 g葛根素，加入PBS(pH=7.0)溶解并定容至10 mL，作為水相；于55 ℃條件下將油相緩慢注入水相中(30 r/min、90 min)，得到乳狀半透明脂質(zhì)體溶液，4 ℃下密封保存，備用。

1.2.5 葛根素脂質(zhì)體質(zhì)量評價

(1)形態(tài)

取脂質(zhì)體適量，加純化水稀釋，再用w(磷鎢酸)=1%的溶液負染色，滴于銅網(wǎng)上，揮干，用透射電鏡觀察形態(tài)。

(2)粒徑、電位、PDI

取脂質(zhì)體適量，加入適量純化水稀釋，置于馬爾文激光粒度儀中測定指標。

1.2.6 脂質(zhì)體凝膠劑的制備

采用冷溶法制備葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠，處方量為w(泊洛沙姆407)=18%和w(泊洛沙姆188)=4%，溶于蒸餾水中，攪拌使其完全溶脹24 h，另取葛根素脂質(zhì)體混懸液，低速攪拌加入溫敏凝膠中，置于4 ℃條件下冷藏，即得。

1.2.7 脂質(zhì)體凝膠劑的質(zhì)量評價

(1)pH值

取樣品適量，以pH計測定其pH值，平行測定3份樣品。

(2)膠凝溫度

采用試管倒置法測定膠凝溫度，精密移取凝膠溶液2 mL于試管中，將試管置于恒溫水浴鍋中(試管內(nèi)液面低于水面)，升溫速率0.5 ℃/min，測試溫度為25～35 ℃，倒置后溶液不流動時溫度記為膠凝溫度，平行3份樣品。

(3)黏度

取樣品適量置于SNB-1型旋轉(zhuǎn)型黏度計中測定，平行3份樣品。

(4)體外釋藥行為考察

人工鼻液配制[16]：精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g于純化水中溶解，加入c(氫氧化鈉)=0.1 mol/L的溶液調(diào)節(jié)pH=6.40，加水至1 000 mL，即得。采用透析袋法考察體外釋藥特性，分別取葛根素溫敏凝膠和葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠2 g置于透析袋中，并放置具塞錐形瓶中，分別加人工鼻液250 mL作為釋放介質(zhì)，錐形瓶置于恒溫磁力攪拌器中，條件為t=(33±0.5)℃、n=150 r/min，于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h分別取樣5 mL，同時補充同溫度同體積介質(zhì)，樣品經(jīng)0.45 μm過濾，按照1.2.1方法進樣分析，計算累積釋放度，以時間為橫坐標，累積釋放度為縱坐標繪制累積釋放曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC定量分析

(1)專屬性實驗

分別將葛根素對照品、葛根素脂質(zhì)體供試品、空白脂質(zhì)體供試品溶液按照1.2.1方法進樣分析，結(jié)果見圖1。

t/min圖1 高效液相色譜圖

由圖1可知，在上述色譜條件下，葛根素色譜峰與雜質(zhì)峰能夠很好分離，且輔料對含量測定無干擾，方法專屬性良好。

(2)標準曲線繪制

分別將對照品系列溶液按照1.2.1方法進樣分析，以峰面積(A)為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=1 588.4ρ+113.92，r=0.999 9，結(jié)果表明ρ(葛根素)=0.1～20 μg/mL線性關系良好。

(3)精密度實驗

精密移取ρ(對照品)=20.0 μg/mL的溶液，按照色譜條件進樣6次，且連續(xù)測定6 d，測定峰面積，結(jié)果日內(nèi)和日間峰面積RSD分別為0.65%、1.22%，表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性實驗

取葛根素脂質(zhì)體按照1.2.3方法制樣，分別于0、2、4、6、8、24 h按照色譜條件進樣分析，結(jié)果峰面積的RSD為1.63%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

(5)重復性實驗

取葛根素脂質(zhì)體6份分別按照1.2.3方法制樣，再按照色譜條件進樣分析，結(jié)果峰面積的RSD為1.87%，表明該方法重復性良好。

(6)加樣回收率實驗

取葛根素脂質(zhì)體9份，每3份1組，按照高中低3個濃度加入對照品溶液，再按照1.2.3方法制樣并進樣分析，結(jié)果平均加樣回收率為95.06%，RSD為0.43%。

2.2 葛根素脂質(zhì)體制備工藝篩選

2.2.1 制備方法篩選結(jié)果

分別取脂質(zhì)體適量，過0.45 μm微孔濾膜，加入PBS(pH=7.0)溶液稀釋，置于激光粒度儀測定粒徑；采用1.2.3方法測定包封率和載藥量，結(jié)果見表1。

由表1可知，采用乙醇注入法得到脂質(zhì)體粒徑較小，包封率和載藥量2個關鍵性指標均優(yōu)于其他2種制備方法。

2.2.2 脂質(zhì)體處方與工藝參數(shù)篩選

根據(jù)上述實驗結(jié)果，初步確定采用乙醇注入法制備葛根素脂質(zhì)體，但在上述處方與工藝參數(shù)條件下脂質(zhì)體包封率略低，需進一步優(yōu)化，結(jié)合文獻資料設定優(yōu)化方案，采用單因素實驗分別考察m(卵磷脂)∶m(膽固醇)、m(葛根素)∶m(卵磷脂)、水化液pH、水化溫度對脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響，見表2。

表2 葛根素脂質(zhì)體處方與工藝篩選

由表2可知，單因素實驗結(jié)果初步篩選出不同因素最佳水平，即m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=8∶1、m(葛根素)∶m(卵磷脂)=1∶15、水化液pH=7.0、水化溫度55 ℃。

2.2.3 脂質(zhì)體制備工藝驗證

按照上述各因素最佳水平進行驗證實驗，最優(yōu)處方為m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=8∶1、m(葛根素)∶m(卵磷脂)=1∶15、水化液pH=7.0、水化溫度55 ℃；制備3批樣品，測得包封率依次為80.07%、79.96%、79.45%，粒徑依次為190.0、191.4、191.8 nm，同處方與工藝參數(shù)篩選結(jié)果基本一致，包封率和粒徑數(shù)值符合要求，表明該工藝合理可行。

2.3 葛根素脂質(zhì)體質(zhì)量評價

2.3.1 形態(tài)

葛根素脂質(zhì)體透射電鏡觀察形態(tài)，結(jié)果見圖2。

圖2 葛根素脂質(zhì)體透射電鏡圖

由圖2可知，脂質(zhì)體呈圓形或類圓形，結(jié)構(gòu)完整，分散性良好。

2.3.2 粒徑、電位、PDI

經(jīng)馬爾文激光粒度儀測定粒徑、電位和PDI的結(jié)果見圖3和圖4。

d/nm圖3 葛根素脂質(zhì)體粒度分布

U/mV圖4 葛根素脂質(zhì)體電位圖

由圖3和圖4可知，平均粒徑為191.1 nm，PDI為0.202，粒徑成正態(tài)分布，平均電位為-33.1 mV，說明脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。

2.4 脂質(zhì)體凝膠劑的質(zhì)量評價

2.4.1 外觀

葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠在相變前為質(zhì)地均勻細膩的淡白色液體，待其達相變溫度時為半固體膠狀。

2.4.2 pH值測定結(jié)果

采用pH計平行測定3份脂質(zhì)體凝膠劑的pH，結(jié)果見表3。

表3 pH測定結(jié)果

由表3可知，葛根素脂質(zhì)溫敏凝膠的pH=6.57。

2.4.3 膠凝溫度測定結(jié)果

采用試管倒置法平行測定3份脂質(zhì)體凝膠劑的膠凝溫度，結(jié)果見表4。

表4 膠凝溫度測定結(jié)果

由表4可知，葛根素脂質(zhì)溫敏凝膠的膠凝溫度為32.5 ℃。

2.4.4 黏度測定結(jié)果

采用黏度計平行測定3份脂質(zhì)體凝膠劑的黏度，結(jié)果見表5。

表5 黏度測定結(jié)果

由表5可知，葛根素脂質(zhì)溫敏凝膠的黏度為52 436 mPa·s。

2.4.5 體外釋藥行為考察結(jié)果

葛根素溫敏凝膠和葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠體外累積釋放曲線見圖5。

t/h圖5 葛根素溫敏凝膠和葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠體外釋藥曲線

由圖5可知，葛根素溫敏凝膠在t=0～6 h處于突釋階段，t≈6 h藥物基本釋放完成，t≈8 h藥物釋放達到平衡，累積釋放度可達86.34%；葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠釋放速度較平緩，36 h累積釋放度為78.50%，具有良好緩釋效果。

3 結(jié) 論

血腦屏障的存在，藥物吸收后進入腦實質(zhì)的量很少，給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來很大困難，亟待研究一種新型給藥途徑，鼻腔給藥具有吸收迅速、腦靶向性等優(yōu)勢?；诖耍髡哌x擇葛根素為研究對象，將其制備成鼻用脂質(zhì)體溫敏凝膠并評價其質(zhì)量，處方組成合理，制備工藝簡便可行，形態(tài)、粒徑、電位、包封率、載藥量、膠凝溫度和體外釋藥等指標符合要求。葛根素脂質(zhì)體溫敏凝膠利用脂質(zhì)體藥物傳遞特點與鼻腔給藥的便捷性，具有良好的溫度敏感性，其達相變溫度時為半固體膠狀，36 h累積釋放度為78.50%，緩釋效果明顯，但其體內(nèi)吸收及生物利用度等情況，有待進一步完成體內(nèi)藥動學實驗驗證。