仙鶴草對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及炎性因子的干預(yù)作用

秦靈靈　王磊　李娟娥　劉銅華

仙鶴草，又名脫力草、龍牙草，系薔薇科植物龍牙草的干燥地上部分，野生于中國各地。仙鶴草性平，味苦澀，歸心、肝經(jīng)，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒的功效，臨床上傳統(tǒng)用于各種出血癥[1]。據(jù)報(bào)道仙鶴草中含有酚、酯、黃酮、鞣質(zhì)、糖苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜皂苷等極其復(fù)雜的化學(xué)成分[2]。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠60只，雄性，8周齡，體重(180±20) g，合格證號：SCXK(京)2006-0009。

1.2藥物與試劑

仙鶴草提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供：仙鶴草全草飲片5 kg，加水煎煮3次，料液比分別為1∶10、1∶10、1∶8，煎煮時(shí)間分別為：1.5、1.5、1小時(shí)，分別過濾合并濾液，濾液減壓濃縮至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，過80目篩，得仙鶴草提取物0.5925 kg(得率11.85%)；艾汀(鹽酸吡格列酮片)15 mg/片，由江蘇太洋醫(yī)藥股份有限公司制造，國藥準(zhǔn)字批號：H20040267；鏈脲佐菌素(STZ)(sigma0130)購自北京博愛商貿(mào)有限公司，批號：B57218；血脂4項(xiàng)生化試劑盒、胰島素放免試劑盒，C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)放免試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

低溫高速離心機(jī)(3κ30，美國Sigma公司制造)；酶標(biāo)儀(Multiskan MK3型，Thermo制造)；水浴鍋(榮華儀器廠)；血糖儀及配套試紙(德國羅氏羅康全)。

1.4飼料

造模大鼠喂養(yǎng)的高脂飼料，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司，配方：基礎(chǔ)飼料65.75%，蔗糖20%，豬油10%，蛋黃粉3%，膽固醇1%，豬膽鹽0.25%，正常組大鼠喂養(yǎng)普通飼料。

1.5動(dòng)物分組及給藥

動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每天12小時(shí)光照維持，晝夜循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取9只為正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)。在飼養(yǎng)4周后，夜間禁食12小時(shí)后腹腔注射STZ(30 mg/kg溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.4)；2周后測定大鼠空腹血糖，測得非同日兩次血糖值≥16.7 mmol/L者為模型成功大鼠。選取造模成功的36只大鼠按血糖高低編號，并按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組、吡格列酮組(4.05 mg·kg-1·d-1)、仙鶴草高劑量組(12 g·kg-1·d-1)和仙鶴草低劑量組(6 g· kg-1·d-1)，中藥以生藥量計(jì)，灌胃給藥4周。正常組和模型組予相同體積的生理鹽水。

1.6取材

取材前禁食不禁水12小時(shí)，斷尾取血測其空腹血糖(FBG)，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，常溫靜置3小時(shí)，2500 g，4℃離心10分鐘，血清，-20℃保存。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1一般情況觀察觀察大鼠毛色、神態(tài)、精神狀態(tài)、活動(dòng)度等情況，隨時(shí)記錄。

1.7.2血清指標(biāo)用德國羅康全血糖儀及配套試紙測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)空腹血清胰島素(fasting serum insulin,Fins)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein，CRP)用放免法測定，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)用全自動(dòng)生化儀測定。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟測定。

1.7.3胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)HOMA-IR=(空腹血糖×空腹血清胰島素)/22.5[3]。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察

正常組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作自如，皮毛有光澤。模型組以及給藥組在喂養(yǎng)高脂飼料階段，體重逐漸上升，出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，皮毛失去光澤的情況，造模結(jié)束給藥后，模型組大鼠以上這些情況逐漸加重的同時(shí)尿量明顯增多。吡格列酮組、仙鶴草高劑量治療組有類似模型組表現(xiàn)，但程度較輕。在給藥階段模型組，吡格列酮組、仙鶴草高低劑量組分別死亡1只，推測原因可能是血糖突然升高，發(fā)生了酮癥酸中毒(DKA)。在取材階段，仙鶴草低劑量組由于取血失敗，造成腹主動(dòng)脈大出血致死。最后正常組、模型組、吡格列酮組、仙鶴草高劑量組進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的大鼠均為8只，仙鶴草組進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的大鼠7只。

2.2仙鶴草提取物對大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影響

模型組與正常組相比FBG升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比FBG下降(P=0.030,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比FBG降低(P=0.013,P<0.05)，說明仙鶴草可降低大鼠血糖；模型組與正常組相比Fins升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比Fins下降(P=0.030,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比Fins降低(P=0.048,P<0.05)，說明仙鶴草可降低血清中胰島素的濃度；模型組與正常組相比HOMA-IR升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比HOMA-IR下降(P=0.006,P<0.01)，仙鶴草高劑量組與模型組相比HOMA-IR降低(P=0.006,P<0.01)，說明仙鶴草可緩解胰島素抵抗。低劑量組有不同程度的改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　仙鶴草提取物對大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

表2　仙鶴草提取物對大鼠血脂的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.3仙鶴草提取物對大鼠血脂水平的影響

模型組與正常組相比血清中TG含量升高(P=0.000，P<0.01)，血清中CHOL含量升高(P=0.000，P<0.01)，LDL-C含量升高(P=0.000，P<0.01)，HDL-C水平降低(P=0.001，P<0.01)。仙鶴草高劑量組與模型組相TG水平降低(P=0.010，P<0.05)，HDL-C水平升高(P=0.005，P<0.01)；吡格列酮組與模型組相比HDL-C水平升高(P=0.009，P<0.01)。見表2。

2.4仙鶴草提取物對大鼠血清炎性因子TNF-α、CRP的影響

模型組與正常組相比血清TNF-α高于正常組(P=0.000，P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比TNF-α下降(P=0.029,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比TNF-α降低(P=0.001,P<0.01)，說明仙鶴草可降低血清TNF-α含量；模型組與正常組相比血清CRP高于正常組(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比CRP下降(P=0.001,P<0.01)，仙鶴草低劑量組與模型組相比CRP降低(P=0.024,P<0.05)仙鶴草高劑量組與模型組相比CRP降低(P=0.015,P<0.05)，說明仙鶴草可降低血清CRP含量。

表3　仙鶴草提取物對大鼠血清炎性 因子的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3　討論

仙鶴草是良好的收斂止血藥，傳統(tǒng)多用于治療各種出血癥，而近年來臨床上將其應(yīng)用又?jǐn)U大到抗糖尿病，抑菌，抗腫瘤，抗心律失常等疾病的治療上，其中有關(guān)仙鶴草降血糖作用的臨床報(bào)道引起了研究者的注意。范尚坦等人一直致力于仙鶴草治療糖尿病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究，在臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用腎上腺素、四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小白鼠動(dòng)物模型驗(yàn)證了仙鶴草的潛在降糖作用，并推測其可能通過對胰島素β細(xì)胞的保護(hù)作用，改善胰島素的分泌缺陷，促進(jìn)胰島素β細(xì)胞分泌胰島素起到降低血糖作用的[4-5]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型多是采用化學(xué)損傷法復(fù)制的糖尿病動(dòng)物模型，其造模原理為通過四氧嘧啶對胰島β細(xì)胞高度選擇的毒性作用，引發(fā)實(shí)驗(yàn)性糖尿病，此類模型多只符合1型糖尿病特征與2型糖尿病的病理特征相差較大，本研究采用于小劑量鏈脲佐菌素加膳食誘導(dǎo)法復(fù)制的更接近于2型糖尿病病理變化及臨床癥狀的2型糖尿病大鼠模型觀察仙鶴草對2型糖尿病的治療作用，借此獲得更可信、更有指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[6-7]。

2型糖尿病患者約占糖尿病患者的90%左右，因此對2型糖尿病的防治已經(jīng)成為了中國一個(gè)嚴(yán)重的社會公共問題。2型糖尿病常由胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退引起，是一種以雙重病理機(jī)制(胰島素抵抗和胰島素分泌缺乏)為特點(diǎn)的代謝性疾病。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征，不僅是其發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素，而且貫穿于其病情發(fā)展的始終。大量的流行病學(xué)研究和臨床研究顯示慢性炎癥反應(yīng)是胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)[8]，而抗炎治療可以改善患者糖、脂代謝異常，提高胰島素敏感性。目前2型糖尿病胰島素抵抗所涉及到的主要炎癥因子包括：(1)急性期反應(yīng)蛋白，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，如C反應(yīng)蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)等[9]；(2)細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6等[10-13]。本實(shí)驗(yàn)以炎性因子TNF-α、CRP為切入點(diǎn)，初步探尋仙鶴草的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，小劑量鏈脲佐菌素加高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病模型大鼠顯示出高血糖血脂異常，高胰島素血癥以及胰島素敏感性降低，血清炎性因子TNF-α、CRP含量升高的特征，經(jīng)高劑量的仙鶴草干預(yù)后，大鼠血糖降低，血清中胰島素含量減少，血脂異常得以改善，并且胰島素敏感性增加，血清炎性因子TNF-α、CRP含量降低。而仙鶴草低劑量組雖然可降低血清中炎性因子CRP含量，但是對于血糖等異常變化的改善作用并沒有顯現(xiàn)出有統(tǒng)計(jì)學(xué)的治療意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷仙鶴草可改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，從降糖調(diào)脂兩個(gè)方面起到抗糖尿病的作用，并且推斷抗炎作用是其作用機(jī)制，但尚需更進(jìn)一步從炎癥反應(yīng)方面對其作用機(jī)制進(jìn)行具體研究，深層次的挖掘其分子作用機(jī)制。另外，本實(shí)驗(yàn)只是對仙鶴草粗提取物進(jìn)行了研究，尚不明確仙鶴草抗2型糖尿病胰島素抵抗作用的有效部位及活性成分，故對仙鶴草抗2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制進(jìn)行多靶點(diǎn)的深層次研究的同時(shí)，篩選出作用的有效成分是日后研究的重點(diǎn)。

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