大蒜提取物抗白念珠菌作用機制研究進展

胡萬超， 唐建國

1 概述

長期以來，中醫(yī)以及其他國家的傳統(tǒng)醫(yī)療就有將大蒜作為一種藥物應用于疾病的預防與治療?，F(xiàn)如今中國、印度、美國、英國以及歐洲的藥典中都收錄了大蒜及其制劑。

大蒜提取物主要是大蒜中的有效成分，隨著醫(yī)學研究的發(fā)展，大蒜提取物也被發(fā)現(xiàn)有多種藥理作用，如抗腫瘤，抗細菌、真菌和原蟲感染，以及對心腦血管疾病有較好療效[1-4]。大蒜提取物主要包括蒜氨酸（alliin）、蒜酶（alliinase）、大蒜辣素（allicin）、大蒜素（diallytrisulfide）。其中蒜氨酸在蒜酶的催化裂合下產(chǎn)生大蒜辣素，而大蒜素是大蒜辣素的降解產(chǎn)物之一，研究發(fā)現(xiàn)大蒜中最重要的生物活性成分為大蒜辣素[5-6]。

白念珠菌是一種機會性感染的真菌病原體，可致人體表面深部感染。近年來，由于全球艾滋病危機[7]，免疫缺陷病患者壽命延長，植入性器械使用增加，廣譜抗生素的長期使用，腫瘤患者放化療治療增加和免疫抑制劑使用增多，使得白念珠菌感染發(fā)病率和死亡率逐年上升[8-9]。研究表明念珠菌感染是導致醫(yī)療相關(guān)血流感染的第三位或第四位原因，也是引起重癥監(jiān)護病房血流感染的主要原因[10-12]。

治療白念珠菌感染的經(jīng)典藥物有唑類、棘白菌素類、多烯類等，但由于長期抗真菌藥物的使用，導致臨床上出現(xiàn)越來越嚴重的耐藥菌株[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物單獨使用具有抗真菌作用，或者輔佐抗真菌藥物治療白念珠菌感染能夠取得更好的療效[14-16]。本文將重點介紹大蒜提取物抗白念珠菌作用的機 制。

2 作用機制

2.1 大蒜提取物對白念珠菌生物特性的影響

白念珠菌是一種具有酵母相和菌絲相的雙相性條件致病真菌，其中菌絲相對宿主的黏附和侵襲能力強，而酵母相毒力較弱，酵母相在適宜條件下可以生成芽管，然后芽管進一步發(fā)展成為菌絲，從而完成酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變，這一過程與白念珠菌致病性密切相關(guān)[17-18]。有實驗證明，大蒜素可以有效抑制白念珠菌芽管的生長[19-20]。一方面可以阻止芽管向菌絲相轉(zhuǎn)變，另一方面由于芽管上有特異性的抗原成分，這些抗原能增強菌體黏附上皮細胞及內(nèi)皮細胞的能力，并能阻止中性粒細胞對菌體的吞噬殺傷作用[21]。阻止芽管的生長，也降低了念珠菌對上皮細胞的黏附和毒力。抑制菌絲形成的機制可能與SIR2基因（沉默子調(diào)控基因）的下調(diào)有關(guān)[22-23]，具體作用機制目前尚未明確。

白念珠菌生長的過程伴隨有生物膜的形成，生物膜將白念珠菌包裹，當宿主細胞行使機體防御或者抗菌藥物作用于白念珠菌時，生物膜就會對白念珠菌形成保護作用，從而增強白念珠菌的感染能力并產(chǎn)生耐藥性。同時生物膜也易附著于植入性材料表面，增加靜脈插管、氣管插管等侵襲性操作時白念珠菌的感染率[24]。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對白念珠菌生物膜的形成有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性和時間相關(guān)性。時間相關(guān)性表現(xiàn)為抑制率隨生物膜的成熟度逐漸降低，對生物膜形成的早期（0～11 h）抑制作用最為顯著，而早期階段主要涉及酵母相黏附、定植以及菌絲形成[12，25-27]。所以早期使用大劑量的大蒜素，對預防和治療白念珠菌感染有更好的效 果。

也有研究顯示一些重要的基因也參與了白念珠菌生物膜的形成。如ALS家族基因（凝集素樣序列家族）和HWP1基因（菌絲細胞壁蛋白基因），大蒜素可以顯著下調(diào)念珠菌中HWP1基因的表達，可能是其抑制生物膜形成的基因靶點，目前對主要的分子機制仍知之甚少[28]。

白念珠菌在生長的過程中分為三個時期，遲緩期（0～24 h）、對數(shù)期（24～48 h）和靜止期（48～72 h），有研究顯示大蒜提取物可以抑制白念珠菌遲緩期的生長，使其延長到48 h，高濃度時還可以殺滅白念珠菌[29]。

2.2 大蒜提取物對白念珠菌生物酶的影響

抗生素的作用機制主要是與微生物中含巰基（-SH）的基團快速反應，從而抑制含巰基的酶。大多數(shù)酶都含有巰基基團，這些基團涉及直接催化反應，能夠維持酶結(jié)構(gòu)的完整性，能與底物結(jié)合，也可以參與變構(gòu)效應，從而影響酶的調(diào)控[30]。大蒜提取物中含有硫代亞磺酸鹽和烯丙基硫醚等化合物，這些含硫有機物可以與巰基結(jié)合，主要作用方式有：①烯丙基硫醚與微生物巰基結(jié)合形成各自穩(wěn)定的二硫化合物，從而使蛋白失活；②競爭性抑制巰基化合物（如半胱氨酸或谷胱甘肽）的活性；③非競爭性抑制，即在變構(gòu)位點通過氧化結(jié)合巰基基團來抑制酶的功能。大蒜提取物通過這三種方式與微生物中含巰基的酶結(jié)合，從而抑制白念珠菌的生長[31]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種含巰基酶，大蒜提取物中所含的化學成分二烯丙基二硫化物可以作用于細胞內(nèi)相應靶點，抑制酶的活性，如果加入谷胱甘肽，此抑制作用可以消失[32]。

白念珠菌能夠產(chǎn)生蛋白酶和磷脂酶，這二種水解酶會導致組織損傷，增加白念珠菌的侵襲力。大蒜提取物中的有機化合物成分二烯丙基二硫化物（DADS）和丙烯基硫（DAS）可以明顯抑制蛋白酶和水解酶的分泌[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)將大蒜提取物中的有機硫化物變?yōu)闊o機硫化物可以增強其抗白念珠菌的效果[34]。

大蒜素也可以間接破壞微生物生長所需的酶，從而達到抗真菌的效果。臨床上有研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌開始對抗真菌藥物耐藥，如兩性霉素B，而大蒜素聯(lián)合兩性霉素B可以增加藥物抗真菌療效[35-36]。兩性霉素B主要抗菌作用是破壞白念珠菌的液泡膜。真菌的液泡中聚集了各種水解酶，包括蛋白酶和核酸酶，還有很多細胞器，它們具有滲透調(diào)節(jié)、離子穩(wěn)態(tài)和細胞體積調(diào)節(jié)的作用。而液泡膜可以維持液泡的完整性，其中麥角甾醇是保證液泡膜流動性和膜相關(guān)功能的必需物質(zhì)，同時液泡膜在酵母細胞內(nèi)吞和同型融合中起至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可以抑制從質(zhì)膜到液泡膜的麥角甾醇轉(zhuǎn)運，從而使液泡破壞，水解酶和細胞器損害[37-38]。也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜油具有親脂性，可以穿透細胞膜和細胞器膜，導致線粒體和其他液泡內(nèi)細胞器損傷，最終導致白念珠菌死亡[39]。

早在1956年Wills[32]就證明大蒜提取物對許多酶都有抑制作用，例如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、琥珀酸酶、黃嘌呤氧化酶等，大多是含巰基的酶，但是否在抗白念珠菌中發(fā)揮作用，只有上述部分得到了證實，其他的酶還有待進一步研究。

2.3 大蒜提取物引起白念珠菌氧化應激反應

氧化應激是細胞凋亡的主要機制之一，其產(chǎn)生的活性氧（ROS）被認為是許多生物和細胞系統(tǒng)中細胞毒性最敏感的預測因子，也是一種公認的細胞凋亡的啟動因子，它可以促進細胞形態(tài)學改變、核分裂、染色質(zhì)縮合、細胞腫脹和膜破壞（主要由于脂質(zhì)過氧化）[40]，從而導致細胞凋亡[41]。目前發(fā)現(xiàn)主要的作用機制：①還原型谷胱甘肽生成減少，大蒜提取物可以顯著降低過氧化氫酶，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，導致谷胱甘肽生成減少，而谷胱甘肽是細胞氧化還原反應中一種重要的還原緩沖液，可以防止氧化性ROS和自由基的產(chǎn)生；②細胞內(nèi)電化學勢能失衡，還原性谷胱甘肽生成減少，使白念珠菌細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例失調(diào)，破壞細胞內(nèi)電化學勢能，直接導致細胞凋亡[42]；③DADS抑制線粒體呼吸鏈，包括電子傳遞鏈復合物Ⅱ～Ⅳ間的一個或多個位點，以及線粒體ATP合酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶，不僅會導致白念珠菌細胞線粒體受損，對自由氧的清除能力降低，ATP合成減少也使還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的含量降低，導致谷胱甘肽的含量降低，白念珠菌破壞和死亡[43-45]；④直接調(diào)控氧化應激相關(guān)的基因，有研究顯示，大蒜提取物可以誘導關(guān)鍵基因的差異表達，這些基因主要集中在19個KEGG通路中，包括參與氧化還原、致病性以及細胞對藥物和饑餓反應的基因[39]。

也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素作用于Yap1p基因，與釀酒酵母對大蒜素的耐藥性相關(guān)。Yap1p基因是釀酒酵母氧化應激反應的中樞調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)節(jié)抗氧化劑和谷胱甘肽的合成[46]。Yap1p在白念珠菌中的作用目前還未開展研究，但有一些研究發(fā)現(xiàn)大蒜素作用于白念珠菌導致大量基因的差異表達，應當注意這些基因的表達，可能不僅與抗菌性相關(guān)，還可能與產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。相關(guān)基因的具體作用機制目前報道還很少，需要進一步研 究。

2.4 大蒜提取物與機體免疫反應

白念珠菌是一種機會性致病菌，當宿主免疫功能低下時，感染白念珠菌的概率會升高，因此機體免疫功能在防御白念珠菌入侵中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，大蒜提取物可以通過增強機體細胞免疫和體液免疫來抵抗白念珠菌感染。

在細胞免疫方面，大蒜素可以通過增強巨噬細胞功能來增強機體的抗白念珠菌能力，主要與提高小鼠NO和IL-12 水平有關(guān)， NO是由活化的巨噬細胞產(chǎn)生的微生態(tài)氣體，在抗白念珠菌反應中發(fā)揮細胞毒性作用，同時NO與活化巨噬細胞殺白念珠菌能力成正相關(guān)。而IL-12可刺激T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，IFN-γ不僅可促進巨噬細胞和內(nèi)皮細胞高表達主要組織相容性復合體（MHC）， 提高抗原提呈效率，而且可促進巨噬細胞的吞噬功能。IL-12也可以直接活化NK細胞和CD8+T細胞，增強細胞的殺菌活性[47-48]。也有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素不僅可以提高正常小鼠T細胞的增殖活性和IFN-γ水平，也能夠增強免疫缺陷小鼠T細胞的增殖活性和IFN-γ水平[49]。

有研究發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細胞的非特異性免疫功能是機體抵抗全身性白念珠菌感染的重要防御機制，而大蒜素可以增強嗜中性粒細胞吞噬和殺菌活性來抵抗白念珠菌的入侵，且在一定范圍呈濃度依賴性[50]。

在體液免疫方面，大蒜素可以提高小鼠IL-4和IgG水平，IL-4主要由T細胞產(chǎn)生，能促進B細胞的增殖、分化和抗體的產(chǎn)生，因此又被稱為B細胞生成因子，所以大蒜素在增強B細胞體液免疫中發(fā)揮了重要的作用[51-52]。

大蒜提取物對宿主免疫方面的研究目前都集中在動物實驗層面，主要通過發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的細胞因子和蛋白的改變來顯示免疫學機制，但更為基礎的細胞實驗和免疫學分子機制還有待進一步研究。

2.5 大蒜提取物的特殊抗菌機制

有研究發(fā)現(xiàn)對Cu2+和Zn2+表達缺陷的念珠菌對大蒜提取物敏感性很高，同時大蒜提取物也可以通過抑制Cu2+和Zn2+的攝取，或者是抑制Cu2+和Zn2+金屬蛋白來降低正常菌株中金屬離子的含量，由此增加念珠菌對大蒜提取物的敏感性，增強抗菌療效[53]。

也有一些學者發(fā)現(xiàn)大蒜素對念珠菌感染的小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)和腎上腺功能有調(diào)節(jié)作用[54-55]，但是否對治療白念珠菌感染有協(xié)同效應，以及具體作用機制，目前還未有進一步的研 究。

3 結(jié)論

綜上所述，大蒜提取物可以通過對白念珠菌以及宿主免疫系統(tǒng)兩方面的影響，來達到抗白念珠菌感染的效果。對白念珠菌的影響主要表現(xiàn)在抑制菌絲、生物膜的形成和芽管生長，對細胞生存必需酶的抑制以及引起細胞氧化應激反應。對宿主方面，大蒜提取物主要是通過增強人體免疫功能來抵御白念珠菌的侵襲，包括體液免疫和細胞免疫。但目前對于這些機制的深入研究還不是很多，而且沒有將其與臨床實踐結(jié)合，來增強臨床治療白念珠菌感染的療效。進一步加強大蒜提取物抗白念珠菌的深入研究，也有助于對大蒜提取物相關(guān)藥物的臨床推廣。