納米刀消融聯(lián)合程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配體-1治療胰腺癌及其免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

李 競，張 肖，張嘯波，魏穎恬，孟亮亮，張 欣，何曉鋒，肖越勇*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心放射診斷科，北京 100853；2.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)影像科，天津 300162)

胰腺癌是難治性腫瘤之一，患者總體5年存活率僅為7%，發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移者5年存活率僅2%[1]。2014年我國胰腺癌發(fā)病人數(shù)約9.22萬，發(fā)病率6.74/10萬，死亡人數(shù)約8.11萬，死亡率5.93/10萬，分別居惡性腫瘤的第10位和第6位[2]，多數(shù)患者確診時已失去手術(shù)機(jī)會。探索非手術(shù)方法治療胰腺癌對改善患者預(yù)后具有重要價值。

不可逆電穿孔(irreversible electroporation, IRE)通過高壓脈沖在腫瘤細(xì)胞膜上打出納米級不可逆空隙而使瘤細(xì)胞凋亡，故又稱納米刀消融[3]，且不破壞消融區(qū)脈管結(jié)構(gòu)，可用于治療胰腺癌[4-5]。

由于胰腺癌特殊的腫瘤微環(huán)境，單一免疫治療效果欠佳，而納米刀消融可在一定程度上逆轉(zhuǎn)免疫抑制，故理論上納米刀消融聯(lián)合免疫治療可改善胰腺癌治療效果。本文圍繞納米刀消融聯(lián)合程序性死亡蛋白-1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡蛋白配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)治療胰腺癌及其免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 納米刀消融聯(lián)合PD-1/PD-L1治療胰腺癌研究進(jìn)展

PD-1/PD-L1是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PD-1/PD-L1信號通路激活有助于腫瘤免疫逃避。PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，其與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后通過負(fù)反饋抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[6]。CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用至關(guān)重要[7-8]，通過抑制PD-1與PD-L1結(jié)合，能夠恢復(fù)T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[9-10]。

目前單純免疫治療對胰腺癌效果欠佳[11-12]，原因可能與胰腺癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定及抗原性較低[13-14]、胰腺癌的易轉(zhuǎn)移性及高侵襲性[15]相關(guān)。此外，胰腺癌突變負(fù)荷低、淋巴細(xì)胞計數(shù)低、存在炎癥因子和缺氧等獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境，亦不利于免疫治療。研究[16]發(fā)現(xiàn)，對胰腺癌患者聯(lián)合應(yīng)用PD-1抑制劑與化學(xué)治療(簡稱化療)藥物，可在一定程度上改善療效。

納米刀消融治療胰腺癌的主要機(jī)制是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，而凋亡可介導(dǎo)免疫耐受，故傳統(tǒng)理論認(rèn)為納米刀消融聯(lián)合免疫治療難以發(fā)揮協(xié)同作用。SHAO等[17]發(fā)現(xiàn)納米刀消融在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫方面優(yōu)于熱消融和冷凍消融，提示納米刀消融聯(lián)合免疫治療可能發(fā)揮協(xié)同作用。目前納米刀消融聯(lián)合PD-1抗體的應(yīng)用研究尚處于起步階段。ZHAO等[18]將納米刀消融與PD-1抗體聯(lián)合用于小鼠原位胰腺癌模型，結(jié)果顯示聯(lián)合治療后小鼠存活時間明顯長于單獨(dú)接受PD-1或納米刀消融者；進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4)抗體、PD-1抗體與納米刀消融，發(fā)現(xiàn)小鼠存活時間反而縮短，甚至低于單用納米刀消融及單用PD-1抗體小鼠，主要原因可能在于CTLA-4抗體毒性過高。

既往研究[19]在納米刀消融治療后的原位小鼠胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤，但CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤并非于治療后立刻發(fā)生，多見于治療后7天前后；而荷異位接種胰腺癌小鼠經(jīng)納米刀消融術(shù)后1天即可見T淋巴細(xì)胞浸潤[20]。盡管已有相當(dāng)數(shù)量的動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但不同動物、不同腫瘤細(xì)胞系、不同接種部位及不同納米刀參數(shù)等均可能影響CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤。胰腺癌患者經(jīng)納米刀消融后何時發(fā)生CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤尚需進(jìn)一步觀察。

2 納米刀消融聯(lián)合PD-1/PD-L1治療胰腺癌的免疫學(xué)機(jī)制

盡管目前尚缺乏系統(tǒng)性研究來解釋小鼠原位胰腺癌模型中納米刀消融聯(lián)合PD-1增強(qiáng)治療效果的原因[14]，但以下3種免疫學(xué)機(jī)制可能參與其中，共同促進(jìn)納米刀消融后腫瘤免疫反應(yīng)，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.1 增強(qiáng)腫瘤抗原性 HE等[21]發(fā)現(xiàn)納米刀通過增加腫瘤細(xì)胞損傷相關(guān)分子模式的合成和分泌而增強(qiáng)特異性T細(xì)胞浸潤和特異性免疫記憶。RINGEL-SCAIA等[22]使用高頻納米刀消融治療4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)小鼠，發(fā)現(xiàn)消融后局部固有免疫系統(tǒng)被激活，抗原呈遞得到增強(qiáng)，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的整體抗腫瘤作用。

熱消融可增強(qiáng)腫瘤免疫[23]。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，納米刀消融治療后，消融區(qū)內(nèi)常存在熱損傷[24]。胰腺癌抗原性較低是其免疫治療效果不佳的主要原因，熱消融破壞的腫瘤細(xì)胞可為免疫系統(tǒng)提供新抗原，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫[23-25]?？乖蔬f細(xì)胞可在細(xì)胞外周吸附抗原，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。CTLA-4抗體可誘導(dǎo)體內(nèi)射頻消融后腫瘤抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞增加并活化[25]。聯(lián)合射頻消融與抗PD-1抗體治療可顯著增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)抗腫瘤免疫能力，延長生存時間[26]。

2.2 介導(dǎo)急性炎性反應(yīng) 當(dāng)前對納米刀消融介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)認(rèn)識仍不夠充分。研究[27]表明納米刀消融通過各種途徑引起急性炎性反應(yīng)，此為其抗腫瘤免疫的重要機(jī)制。RINGEL-SCAIA等[22]報道,高頻納米刀消融可改變?nèi)橄侔﹥?nèi)具有免疫抑制作用的腫瘤微環(huán)境，主要通過納米刀消融的促炎癥和促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答而使腫瘤由抗炎狀態(tài)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)。

細(xì)胞焦亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，為細(xì)胞在應(yīng)激及感染狀態(tài)下應(yīng)對不良環(huán)境的病理性改變。作為一種物理消融技術(shù)，納米刀通過在細(xì)胞膜上打開孔洞導(dǎo)致鉀離子和其他離子外流和內(nèi)流，鉀離子外流誘導(dǎo)焦亡發(fā)生[27]。ZHANG等[28]對大鼠正常肝組織進(jìn)行納米刀消融，分別在消融術(shù)后1、3、6、24 h對消融肝組織進(jìn)行HE、Masson和Tunel染色，并通過蛋白質(zhì)印跡法檢測焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示消融后6～24 h消融區(qū)內(nèi)細(xì)胞焦亡和壞死活躍，證實(shí)納米刀消融可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡。WANG等[29]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在治療后即使發(fā)生少量焦亡也可以趨化CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部聚集，從而有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞本身也會通過不同信號通路誘導(dǎo)焦亡發(fā)生[30]。

2.3 逆轉(zhuǎn)免疫抑制 納米刀消融通過改變腫瘤微環(huán)境使腫瘤從抗炎狀態(tài)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)，使胰腺癌由原有的免疫沙漠型向免疫炎癥型轉(zhuǎn)變[31]。O'NEILL等[32]發(fā)現(xiàn)納米刀消融后腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)較前增加，提示納米刀消融聯(lián)合PD-1的效果可能優(yōu)于單純使用PD-1。NARAYANAN等[33]報道，納米刀聯(lián)合PD-1和Toll樣受體7(TLR7)可增加胰腺癌小鼠的生存時間和CD8+T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞浸潤。

納米刀消融逆轉(zhuǎn)免疫抑制的機(jī)制可能包括以下方面。首先，納米刀消融作為一種物理消融手段損傷消融區(qū)內(nèi)存在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，殺傷了消融區(qū)內(nèi)起免疫抑制作用的髓源性抑制細(xì)胞、胰腺星型細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等[34]。AL-SAKERE等[35]對小鼠皮下肉瘤進(jìn)行納米刀消融，術(shù)后0、2、6 h分別檢測巨噬細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6 h內(nèi)上述免疫細(xì)胞均逐漸減少，其原因可能為納米刀消融直接殺傷腫瘤內(nèi)所有細(xì)胞，包括免疫細(xì)胞。PANDIT等[34]對經(jīng)納米刀消融與胰腺癌切除術(shù)治療的胰腺癌患者分別于術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后1、3、5天檢測外周血CD4+Treg細(xì)胞的3個亞群(CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3+、CD4+CD25+FoxP3+)，結(jié)果顯示相比手術(shù)切除腫瘤患者，納米刀消融后患者的CD4+CD25+FoxP3+Treg亞群細(xì)胞水平在術(shù)后第5天達(dá)到最大降幅，提示納米刀消融可通過損傷Treg細(xì)胞發(fā)揮抗免疫抑制作用，為聯(lián)合免疫治療提供時間窗，使應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果達(dá)到最大化。其次，納米刀消融改善腫瘤內(nèi)低氧。ZHAO等[18]采用蛋白質(zhì)印跡法在蛋白水平檢測納米刀消融術(shù)后低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor, HIF-1α)表達(dá)，結(jié)果顯示納米刀消融后4天腫瘤組織HIF-1α表達(dá)僅為對照組的53%；同時以異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的右旋糖酐檢測消融后腫瘤血管通透性，結(jié)果顯示通透性顯著增加，峰值出現(xiàn)于術(shù)后第4天，其原因可能與納米刀消融術(shù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。腫瘤內(nèi)缺氧是免疫抑制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，改善瘤內(nèi)缺氧環(huán)境可增強(qiáng)抗腫瘤免疫。最后，腫瘤內(nèi)的細(xì)胞因子及外泌體是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要部分[1]，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信號能夠減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在胰腺癌組織中聚集。納米刀消融導(dǎo)致消融區(qū)內(nèi)大量分泌細(xì)胞因子及外泌體的細(xì)胞死亡，抑制腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子及外泌體釋放，使腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[34]。

3 小結(jié)與展望

納米刀消融聯(lián)合PD-1治療胰腺癌尚處于探索階段，還存在許多問題有待明確。目前1B期臨床試驗(yàn)業(yè)已證實(shí)納米刀聯(lián)合納米單抗治療胰腺癌具有良好的耐受性[32]。進(jìn)一步系統(tǒng)研究納米刀影響免疫微環(huán)境的機(jī)制，才有利于臨床恰當(dāng)?shù)貙⒚庖忒煼ㄅc納米刀消融相結(jié)合，使患者最大程度獲益并改善預(yù)后。