外泌體在骨重建以及骨質(zhì)疏松中的研究進(jìn)展

陳逸青章秋代芳

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 合肥 230022

外泌體(exosomes)是一種由多種細(xì)胞分泌的、直徑為30～100 nm、大小均一的脂質(zhì)雙分子層膜衍生囊泡。外泌體內(nèi)包含mRNA、miRNA、多種類型的蛋白質(zhì)，參與了腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞間通訊和血管再建等重要生理過程。近期很多研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過信號蛋白、miRNA等方式調(diào)控骨吸收和骨生成的動態(tài)平衡，從而在骨代謝疾病例如骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，并可能成為臨床上潛在的生物標(biāo)志物、藥物遞送以及基因治療的載體[1-2]。本文將就骨細(xì)胞分泌的外泌體在骨重建和骨質(zhì)疏松中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性

1.1 外泌體的結(jié)構(gòu)與組成

多種細(xì)胞均可以分泌外泌體，如各種干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血小板、精子、心肌細(xì)胞等。在大多數(shù)體液中，可檢測到外泌體，如外周血、尿液、唾液、乳汁等[3]。最新的研究[4]發(fā)現(xiàn)骨相關(guān)的細(xì)胞包括破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞也分泌外泌體。

外泌體具有脂質(zhì)雙層膜，其脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)中含有豐富的鞘磷脂、膽固醇、神經(jīng)酰胺及脂筏結(jié)構(gòu)域等，可防止外泌體內(nèi)部的RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)在細(xì)胞外環(huán)境中被破壞。

外泌體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)。其中，肌動蛋白、微管蛋白等細(xì)胞骨架成分在外泌體內(nèi)部和表面分布較多，參與了外泌體的結(jié)構(gòu)形成。外泌體除了含有一些四跨膜區(qū)蛋白質(zhì)超家族成員、信號分子等，還同時含有大量與其組織和細(xì)胞來源相關(guān)的特異蛋白，其蛋白成分依來源細(xì)胞的不同而存在差異，這些蛋白可反映出細(xì)胞來源的組織/細(xì)胞類型。此外，外泌體內(nèi)還含有較多的miRNA。miRNA為短鏈非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種靶基因的過程。目前，miRNA已成為基礎(chǔ)與臨床科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，且已有不少研究提示miRNA可作為治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物[5-6]。

1.2 外泌體的形成過程

外泌體的形成主要通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，包括3個步驟：第一步，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成細(xì)胞內(nèi)小泡，此為早期；第二步，晚期內(nèi)體中的微粒體膜再次內(nèi)陷形成多泡小體；第三步，多泡小體與細(xì)胞膜特定部位融合，囊泡中的內(nèi)容物釋放，即為外泌體。外泌體的大小取決于其來源的細(xì)胞類型及其脂質(zhì)雙層膜的結(jié)構(gòu)。

1.3 骨起源的外泌體的特點(diǎn)

骨細(xì)胞相關(guān)的外泌體內(nèi)的成分與其他來源的外泌體存在差異。在骨重建的微環(huán)境中，骨起源的外泌體包含一些特殊的成骨蛋白，如骨形成蛋白1-7(bone morphogenetic protein 1-7，BMP 1-7)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)以及真核起始因子2和非膠原基質(zhì)蛋白如骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨粘素(osteonectin，ON)等[7]。骨細(xì)胞相關(guān)的外泌體也包含破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白如核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)以及核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB，RANK)[4,8]。骨起源的外泌體還有一些骨重建相關(guān)的miRNA，如miR-24、let-7、miR-143-3p、miR-10b-5p、miR-199b、miR-218、miR-214-3p[9-10]。這些miRNA在成骨以及破骨細(xì)胞的分化中起到重要的作用。骨相關(guān)外泌體內(nèi)的miRNA的數(shù)量和分布與其他細(xì)胞的外泌體內(nèi)的miRNA的數(shù)量和分布是不一致的，表明miRNA選擇性地被運(yùn)輸至骨相關(guān)的外泌體并運(yùn)輸了特異的信息[11]。另外，骨相關(guān)的外泌體內(nèi)還有特異的mRNA，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的BDP1、TAF7L、SOX11和具有激酶活性的LPAR1及ZEB2等[12]。

生理改變以及化學(xué)物質(zhì)可以影響骨重建過程中外泌體的釋放頻率和內(nèi)容。早期的原始BMSCs較晚期釋放外泌體較少[11]。另外，外泌體的miRNA種類在成骨誘導(dǎo)時與非成骨誘導(dǎo)時也是不同的[13]。年齡也可以影響外泌體的miRNA譜。年輕小鼠骨髓組織液分離出的miR-183簇(miR-96/-182/-183)明顯高于其他年齡段的小鼠[14]。另外，外泌體釋放的頻率也與病理情況有關(guān)，比如炎癥、缺氧和pH的變化[15-16]。一些分子，如1α、25-(OH)2D3以及丙咪嗪也可以調(diào)節(jié)外泌體的產(chǎn)生以及成熟[17-18]。

2 外泌體在骨重建中的作用

骨重建是指去除局部舊的和老的骨代之以新骨的過程，起到防止骨骼老化、增加骨密度的作用。骨重建持續(xù)終身，是成熟骨組織的一種替換機(jī)制，不僅可預(yù)防骨組織疲勞損傷的積累，還保持了骨生物力學(xué)功能，并有助于礦物質(zhì)的穩(wěn)定。該過程極為復(fù)雜，需一系列的細(xì)胞過程參與，如破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及BMSCs。同時還需要諸多細(xì)胞以及分子因子參與。其中，外泌體在骨吸收以及骨形成方面起到重要作用。只有骨吸收和骨形成動態(tài)平衡，才能保持骨的健康。

2.1 外泌體與破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，是由破骨細(xì)胞前體在各種化學(xué)因子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子等信號因子的刺激下發(fā)育成熟而來。在骨吸收的過程中，活躍的破骨細(xì)胞將會分泌酸性物質(zhì)和酶，對礦化的骨基質(zhì)進(jìn)行分解吸收，使得該區(qū)域的骨量發(fā)生下降。

Huynh等[8]最近報道了破骨細(xì)胞前體的外泌體有刺激破骨細(xì)胞成熟化的作用。然而通過對成熟的破骨細(xì)胞培養(yǎng)，卻發(fā)現(xiàn)其分泌的外泌體抑制了破骨細(xì)胞生成。RANK水平在成熟破骨細(xì)胞的外泌體中十分豐富，然而在損耗了這些外泌體里富含的RANK后，發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的抑制破骨細(xì)胞形成作用減弱。因此表明外泌體通過表達(dá)RANK與破骨細(xì)胞表面的RANKL結(jié)合，從而競爭性的抑制破骨細(xì)胞的RANK通路的激活，也就是說，破骨細(xì)胞起源的外泌體是破骨細(xì)胞旁分泌的重要調(diào)節(jié)因子。最新的一些研究發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞外泌體內(nèi)的miRNA也參與了骨重建的過程。破骨細(xì)胞起源的miRNA是一組有破骨細(xì)胞釋放的可以抑制成骨細(xì)胞分化的偶聯(lián)因子。miR-214-3p被發(fā)現(xiàn)在骨折的老年婦女以及去卵巢小鼠中顯著增加，表明了miR-214-3p可能與骨形成減少有關(guān)[9]。Wang等[19]也發(fā)現(xiàn)血清miR-214水平增加與老年骨折病人骨切片的骨形成減少有關(guān)。同時，注射化學(xué)合成的寡核苷酸拮抗miR-214-3p可以改善小鼠低骨量[1,9]。Sun等[1]通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞中miR-214水平的提高以及其抑制成骨細(xì)胞活性的功能是通過膜上EphrinA2/EphA2相互作用來實(shí)現(xiàn)的。同時，miR-214也可以通過與成骨細(xì)胞的ATF4結(jié)合以抑制骨形成[19]。Zhao等[20]通過研究骨髓巨噬細(xì)胞還發(fā)現(xiàn)miR-214促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成還可以通過PI3K/Akt通路。以上研究均表明了存在于破骨細(xì)胞外泌體的miR-214通過多種通路的相互作用而促進(jìn)了骨吸收，影響了骨形成。也有其他研究發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞以及其前體的外泌體可以刺激BMSCs的成骨分化[21-22]。綜上所述，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的外泌體的作用可能是雙向的，其中的分子機(jī)制對骨重建的影響尚未明確，尚需進(jìn)一步探究。

2.2 外泌體與成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的BMSC分化而來，是骨形成的主要功能細(xì)胞，能特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程。與破骨細(xì)胞一樣，成骨細(xì)胞也由成骨細(xì)胞前體發(fā)育成熟而來，并移行至骨吸收陷窩，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化進(jìn)而形成新骨。Deng等[4]發(fā)現(xiàn)UAMS-32P細(xì)胞系(一種成骨細(xì)胞系)分泌的外泌體含有RANKL蛋白，可以通過與細(xì)胞表面的RANKL結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的RANK信號通路，導(dǎo)致了破骨細(xì)胞的形成。同樣，Solberg等[23-24]發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白-1(lysosomal membrane protein-1，LAMP-1)陽性的成骨細(xì)胞外泌體攜帶了RANKL、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，從而可以提高破骨細(xì)胞形成。另外，成骨細(xì)胞的外泌體還可以通過加強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和礦化促進(jìn)骨重建過程[25]。Cui等[24]發(fā)現(xiàn)礦化的成骨細(xì)胞形成的外泌體miRNA促進(jìn)了成骨的分化，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和堿性磷酸酶來促進(jìn)骨形成。還有研究發(fā)現(xiàn)了多種信號通路可以介導(dǎo)骨形成。成骨細(xì)胞起源的外泌體里的miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378b、miR-677-3p以及miR-378表達(dá)是明顯升高的，它們是通過Wnt信號通路、胰島素信號通路、TGF-b信號通路以及鈣信號通路等來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和發(fā)揮功能[24,26]。綜上，成骨細(xì)胞的分化形成受到了多種因素、多種信號通路以及miRNA的調(diào)控，成骨細(xì)胞分泌的外泌體可以促進(jìn)或者抑制成骨細(xì)胞的分化。

2.3 外泌體與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，它是一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的多種分化潛能的細(xì)胞亞群。很多研究表明，BMSCs有多種功能如促進(jìn)組織修復(fù)[27]、神經(jīng)保護(hù)[28]及多向分化潛能[29]等，其作用方式尚不清楚，在近期的一些研究[30]中發(fā)現(xiàn)外泌體可能是其中一種作用機(jī)制。

Xu等[13]2014年第一次對在BMSCs成骨過程中的外泌體內(nèi)的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究之后發(fā)現(xiàn)，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p 以及miR-302b等九種miRNA在BMSCs起源的外泌體中的表達(dá)是明顯升高的。其中，let-7a被發(fā)現(xiàn)是通過調(diào)節(jié)HMGA2基因表達(dá)來抑制脂肪形成從而促進(jìn)骨形成[31]。miR-218是通過Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)人脂肪來源的干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化[32]。同時，Xu等也發(fā)現(xiàn)miR-221、miR-155、miR- 885-5p、miR-181a以及miR-320c在BMSCs起源的外泌體中的表達(dá)是下調(diào)的。其中，miR-221的下調(diào)可以起到促進(jìn)人非限制成體干細(xì)胞的成骨分化[13]。miR- 885-5p、miR-181a可以分別通過靶向Runx2、以及T?R-I/Alk5基因抑制成骨細(xì)胞活性以及分化，故其水平下調(diào)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活化[33]。在動物實(shí)驗(yàn)中，有研究者[34]發(fā)現(xiàn)，BMSCs起源的外泌體中富含miR-196a，其可以促進(jìn)顱骨缺損的SD大鼠的骨形成，這項研究也為BMSCs分泌的外泌體在未來骨代謝相關(guān)疾病的臨床治療提供了新的思路和方法。

2.4 外泌體與血管化

對于骨骼來說，骨量的增長離不開新生血管的形成以及氧氣和營養(yǎng)的供給。有研究表明血管的新生需要活性可溶性的生長因子如纖維母細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化。在對MSCs起源的外泌體的質(zhì)譜分析后發(fā)現(xiàn)，其包含了可溶性的生長因子如VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFB1)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)，同時大量存在轉(zhuǎn)錄因子如肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來促進(jìn)血管生成。同樣地，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體富含Wnt信號通路的重要效應(yīng)分子-人T細(xì)胞因子4(T-cell factor 4，TCF4)，可以通過外泌體的細(xì)胞間信息傳遞促進(jìn)血管生長。Chen等[35-36]發(fā)現(xiàn)MSCs起源的外泌體含有的miRNA如miR210、miR-126、miR-136和miR-21都參與了血管新生，同時含有的miR-6087可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化。在動物實(shí)驗(yàn)中，也有很多研究發(fā)現(xiàn)BMSCs起源的外泌體有改善缺血缺氧性損傷的作用。Qi等[37]發(fā)現(xiàn)人類多潛能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)起源的MSCs的外泌體可以通過誘導(dǎo)骨形成和血管再生來促進(jìn)骨再生，同時發(fā)現(xiàn)外泌體可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性以及促進(jìn)骨形成標(biāo)志物如RUNX2和1型膠原(collagentype1，COL1)的表達(dá)。由此可見，外泌體在血管外再生以及組織新生方面可能起到重要作用，而具體作用機(jī)制尚未明了。

3 外泌體與骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥是由多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病。Liu等[38]利用間質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)(mesenchymal stem cell transplantation，MSCT)將正常小鼠的間質(zhì)干細(xì)胞移植到狼瘡所致的骨質(zhì)疏松表型的小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常BMSCs分泌的外泌體含有Fas蛋白，將正常的外泌體轉(zhuǎn)移至缺乏Fas蛋白的狼瘡所致的骨質(zhì)疏松表型的小鼠體內(nèi)后，結(jié)果miR-29b 含量顯著降低，而細(xì)胞內(nèi)甲基化酶Dnmt1活性升高，進(jìn)而Notch啟動子甲基化水平提高，抑制了Notch基因的表達(dá)，最終可以恢復(fù)小鼠BMSCs的成骨分化能力，增加小鼠股骨骨密度以及骨體積分?jǐn)?shù)，促進(jìn)骨形成，從而起到治療小鼠骨質(zhì)疏松的作用。Zuo等[39]提取BMSC起源的外泌體通過靜脈注射入大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可以顯著改善因放療導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。Qi等[37]使用hiPSC-MSC-Exos+載體β-TCP支架技術(shù)治療骨質(zhì)疏松合并顱骨缺損的大鼠，發(fā)現(xiàn)hiPSC起源的MSCs的外泌體可以顯著刺激顱骨缺損的骨再生和血管形成，且外泌體濃度越高，效果越明顯。以上對BMSCs外泌體的研究都在骨質(zhì)疏松動物模型體內(nèi)成功應(yīng)用，也為人類骨質(zhì)疏松的治療提供了新的思路和方法。

外泌體除了在治療前景方面值得關(guān)注以外，在作為骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物、非侵入性的診斷工具以及疾病進(jìn)展預(yù)后指標(biāo)方面也有很高的應(yīng)用前景。如前文所述，miR-214-3p以及miR-214-3已經(jīng)在多個動物以及人體研究中被發(fā)現(xiàn)其在患有骨質(zhì)疏松時顯著增加，可以作為骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物[1,9]。另外還有研究[40]發(fā)現(xiàn)，在年齡大于55歲的骨質(zhì)疏松患者的血漿中，miR-31水平較年齡小于25歲的健康對照組明顯升高，并證實(shí)了miR-31可能調(diào)控了與年齡相關(guān)的骨量減少以及骨質(zhì)疏松的病理過程，未來將可能在骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)志物以及診斷方面得到運(yùn)用。

4 外泌體的應(yīng)用前景

骨來源的外泌體提取簡單，操作侵入性小，從健康捐獻(xiàn)者的骨髓中即可以提取BMSCs來源的外泌體，同時可以在-20 ℃儲存6個月而不改變生物活性，便于儲存和運(yùn)輸[41]；同時外泌體治療較細(xì)胞基礎(chǔ)的治療有毒性小，安全性高[42-43]。另外，因?yàn)橥饷隗w不表達(dá)細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的MHC-I 和MHC-II，所以較以細(xì)胞基礎(chǔ)的移植治療降低了免疫原性。MSCs起源的外泌體同樣保存了特有的免疫特點(diǎn)，在未來可能幫助研究者發(fā)現(xiàn)新的免疫治療方法[44]。同時，與活細(xì)胞靜脈輸注相比，外泌體更加穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)注射避免了異倍體的風(fēng)險以及滯留于血循環(huán)遠(yuǎn)端的微脈管系統(tǒng)堵塞。亦有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs和miRNA在骨修復(fù)和重建中起到重要作用[45-47]。以上發(fā)現(xiàn)表明了干細(xì)胞起源的外泌體在未來骨修復(fù)重建的臨床治療中可能具有重要的應(yīng)用價值。

綜上所述，本文主要闡述了外泌體在成骨形成、破骨形成、血管形成中的作用以及在骨質(zhì)疏松方面的應(yīng)用。然而外泌體在骨重建中介導(dǎo)信號通路中具體分子機(jī)制的研究尚在初始階段，未來臨床應(yīng)用也面臨著許多尚未解決的問題。但隨著研究的深入，新的外泌體也將逐漸被發(fā)現(xiàn)，外泌體與靶細(xì)胞的分子作用機(jī)制以及在骨質(zhì)疏松臨床應(yīng)用中的價值會被進(jìn)一步挖掘，未來的應(yīng)用前景將十分廣闊。