牛源ATG13的克隆表達及功能分析

王悅縈，李方琳，粟雨芯，李凌浩，馬忠仁

（1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

細胞自噬與凋亡同時參與細胞損傷時的應激反應，并受到嚴格的基因層面的調(diào)控[1-3]。自噬相關蛋白不僅可以參與自噬的重要功能來調(diào)控病毒的入侵，而且還能作用于天然免疫信號通路來調(diào)控病毒的入侵及復制，而自噬小體從形成到降解的整個過程中是ATG蛋白的直接參與和調(diào)控[4-6]。

ATG是一組進化保守的基因，參與自噬過程中細胞質(zhì)到液泡的運輸過程[7]。Atg13最初作為一種結構性表達蛋白在酵母中被發(fā)現(xiàn)，該蛋白在基因層面與 Atg1 相連，后者是自噬所需的一種蛋白激酶。自噬過程需要 Atg1 與 Atg13 之間的直接結合。由于ATG13蛋白在細胞自噬的起始階段起關鍵的作用，所以本研究選取了牛的autophagy related gene 13（ATG13）為研究對象[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 感受態(tài)細胞DH5α、牛腎細胞（Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK）由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心保存、原核表達菌株 BL21 (DE3)為北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品；pGEX-6P-1質(zhì)粒由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 2×Ex Taq Master Mix、DL2000、T4 ligase；Blueplus II Protein Marker；IPTG 、GST標簽抗體、山羊抗小鼠抗體，購自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從Genbank中找到ATG13全基因序列，使用Primer Primer 5.0軟件設計引物，用于擴增ATG13的編碼基因。引物序列如下：

ATG13-BamHI-F：5′ -CGGGATCCATGG AAACTGATCTTAATTCCCAGGACA-3′

ATG13-XhoI-R：5′-CCCTCGAGTTACTG CAGGGTTTCTACAAAGGCA-3′

該引物擴增的目的片段長度為1 440 bp。

1.2.2 ATG13的編碼基因的擴增與克隆 由MDBK細胞中獲取ATG13編碼基因，PCR擴增基因。使用One Step RT-PCR Kit Ver.2進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的基因片段。

1.2.3 原核表達載體的構建及鑒定 BamHI和Xho I雙酶切ATG13基因片段和pGEX-6P-1；瓊脂糖凝膠電泳并回收目的基因和線性化的pGEX-6P-1載體。將回收的ATG13基因片段與線性化的pGEX-6P-1載體用T4連接酶于16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆菌落放大培養(yǎng)，BamHI和Xho I雙酶切鑒定并命名為pGEX-6P-1-ATG13，-20℃保存，備用。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達及鑒定 鑒定為陽性的重組表達載體命名為pGEX-6P-1-ATG13，將其轉化表達菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆，過夜培養(yǎng)后轉接到10 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導目的基因表達，在誘導后的不同時間點收集菌體，進行SDS-PAGE分析。收集誘導后菌體，經(jīng)超聲破碎后，取上清液進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白的Western blot分析 將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳后轉膜，5% BSA封閉2 h，與稀釋于5% BSA 的ATG13單抗4℃過夜孵育，TBST洗膜。再與稀釋于5% BSA的辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG室溫下孵育2 h，TBST洗滌后，使用化學發(fā)光液進行化學發(fā)光。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果及重組原核表達載體的鑒定

經(jīng) PCR擴增得到的目的片段大小約1 440 bp，與預期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ATG13經(jīng)BamHI和 Xho I雙酶切，電泳后出現(xiàn)1 440 bp的目的條帶，證明重組表達構建結果成功（圖2）。

圖1 ATG13基因的擴增

圖2 ATG13重組質(zhì)粒的雙酶切驗證

2.2 重組蛋白的Western blot分析

將pGEX-6P-1-ATG13轉化至感受態(tài)細胞中并制成SDS樣品。對融合蛋白進行鑒定，使用考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)：pGEX-6P-1空載體標簽表達蛋白約25kD大小。pGEX-6P-1-ATG13質(zhì)粒融合ATG13蛋白和GST標簽蛋白大小約78kD左右，并且隨著誘導時間的延長，蛋白表達量逐漸增加（如圖3所示）。之后進行轉膜，分別使用一抗ATG13單抗和羊抗兔二抗進行孵育，用化學發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光后在相對分子質(zhì)量大約78kD位置有目標條帶（圖4）。Western blot結果顯示，重組融合了GST標簽的ATG13蛋白正常表達且大小為78kD左右。

圖3 ATG13的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖4 ATG13的Western blot分析

3 討論

細胞自噬（Autophagy）是細胞在自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程[9-11]。

在大多數(shù)宿主中，當營養(yǎng)缺乏時或其他外因或內(nèi)因均可誘導自噬產(chǎn)生。自噬途徑的激活依賴于ULK復合體，該復合體是細胞自噬網(wǎng)絡中的一個重要的節(jié)點[12]。眾多的研究表明，ATG13蛋白是組成ULK復合體的重要亞基，本研究顯示ATG13蛋白的大小為53KD，在自噬過程中發(fā)揮重要的生理功能，是自噬研究的重要環(huán)節(jié)。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)ATG13蛋白除了啟動自噬過程外，還參與了細胞其他重要的生理過程，如基因修復、蛋白逆轉運、細胞凋亡以及免疫應答等，具體過程還需做更深層次的研究[13-14]。