腎茶總黃酮調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制*

郭銀雪 葛平玉

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽550004）

急性腎損傷（Acute Kidney Injury,AKI）是一種常見的由于外傷、手術(shù)、膿毒血癥、腎毒性藥物等因素引起的獲得性并發(fā)癥，在臨床中有較高的發(fā)病率和致死率，具有起病急、進(jìn)展快的特點(diǎn)[1]。手術(shù)、外傷、膿毒血癥、腎毒性藥物等因素引起的腎缺血-再灌注損傷，是AKI發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素[2]。研究表明，過氧化損傷引起腎小管上皮細(xì)胞（TECs）過度凋亡是腎缺血-再灌注損傷的重要病理過程；現(xiàn)代藥理研究也證明，腎茶黃酮類成分具有良好的清除自由基和抗氧化的作用[3]。我們推測腎茶總黃酮能通過減輕過氧化損傷以減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡的途徑，達(dá)到減輕急性腎損傷的作用，本研究針對(duì)這一方面進(jìn)行了觀察探討。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購進(jìn)的60只清潔級(jí)雄性2月齡SD大鼠作為研究對(duì)象，體質(zhì)量在250～300 g之間，自由飲食常規(guī)大鼠飼料，大鼠許可證號(hào)：SCXK（黔）2016-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥、試劑和儀器 腎茶地上部分全草，為唇形科植物貓須草 [Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu]的地上部分，從貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房購進(jìn)。腎茶總黃酮（TFC）采用最佳提取工藝提取獲得[4]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase,NOS） 和 丙 二 醛（Malonyldialdehyde,MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TUNEL檢測試劑盒（羅氏Roche公司），羅氏全自動(dòng)生化分析儀，熒光顯微鏡（日本Olympus公司），MR23i離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.3 動(dòng)物模型建立 制模手術(shù)前6 h禁食，麻醉前稱重，預(yù)先制備10%的水合氯醛，腹腔注射麻醉，劑量按0.4 ml/100 g計(jì)算。麻醉后，大鼠取仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，常規(guī)腹部手術(shù)備皮，碘伏消毒鋪無菌敷料，充分暴露手術(shù)區(qū)域。自腹正中行縱行切口進(jìn)入腹腔，找到右腎后常規(guī)切除；充分游離暴露左腎及左腎動(dòng)脈，無損傷動(dòng)脈阻斷左腎動(dòng)脈，左腎顏色由紅潤變?yōu)樯n白表示左腎急性缺血。阻斷1 h后恢復(fù)灌注，左腎顏色重回紅潤，提示成功恢復(fù)灌流。

1.4 分組與給藥 60只雄性實(shí)驗(yàn)SD大鼠，常規(guī)飼料喂養(yǎng)7 d，采用信封法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、腎茶總黃酮小劑量治療組和腎茶總黃酮大劑量治療組，每組15只。模型組及腎茶總黃酮小劑量治療組和腎茶總黃酮大劑量治療組均需構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型。通過人與大鼠按體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算各組給藥劑量。對(duì)照組、模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃（按1 ml/100 g劑量計(jì)算用量），治療組以腎茶總黃酮溶液灌胃（大劑量組400 mg/kg、小劑量組100 mg/kg），治療4 d。

1.5 觀察指標(biāo) （1）血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）檢測：采集大鼠尾靜脈血5 ml，注入離心管離心10 min，血清低溫保存，采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀測定Cr和BUN。（2）SOD活性通過黃嘌呤氧化酶法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，NOS活性采用化學(xué)比色法測定。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后常規(guī)碘伏消毒鋪?zhàn)灾剖中g(shù)洞巾；打開腹腔，無菌條件下取出左腎，切取一半左腎，用4℃預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液洗凈血液，吸干水分，用眼科剪剪取一半腎組織，稱重，按10 ml/g加0.9%氯化鈉溶液，使用玻璃勻漿器勻漿，制成10%腎組織勻漿，轉(zhuǎn)速4 000 r/min（r=142 mm），離心 10 min，取上清液置 4℃保存檢測。（3）TECs凋亡指數(shù)測定[5]：采用DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法 [Terminal Dexynucleotidyl Transferase（TdT）-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL]檢測TECs凋亡，用10%福爾馬林固定剩余的一半左腎，依次進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，制成4 μm切片，行TUNEL檢測。應(yīng)用圖文分析報(bào)告系統(tǒng)隨機(jī)采集10個(gè)不連續(xù)不重復(fù)高倍鏡視野（HPF，40×物鏡），記錄每個(gè)視野TUNEL陽性TECs個(gè)數(shù)。腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（Apoptotic Index,AI）=陽性細(xì)胞數(shù)/視野所見細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用最小極差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠BUN和Cr水平比較 模型組肌酐、尿素氮水平與對(duì)照組比較顯著升高（P＜0.05），顯示造模成功；腎茶總黃酮大劑量治療組治療4 d后與模型組相比較，BUN和Cr明顯下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠BUN和Cr水平比較（±s）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠BUN和Cr水平比較（±s）

注：與模型組相比較，*P＜0.05；與對(duì)照組相比較，△P＜0.05。

組別nBUN（mmol/L）Cr（μmol/L）腎茶總黃酮小劑量組腎茶總黃酮大劑量組模型組對(duì)照組15 15 15 15 20.13±1.44 15.13±1.44*25.34±2.46△13.84±1.53 76.64±11.21 68.64±11.21*94.76±13.83△55.41±9.83

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠AI和腎組織內(nèi)SOD、MDA、NOS含量比較 與模型組相比較，腎茶總黃酮大劑量組AI和腎組織MDA、NOS含量顯著降低（P＜0.05），SOD水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠AI和腎組織內(nèi)SOD、MDA、NOS含量比較（±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠AI和腎組織內(nèi)SOD、MDA、NOS含量比較（±s）

注：與模型組相比較，*P＜0.05；與對(duì)照組相比較，△P＜0.05。

組別 n AI（%）SOD（×103U/g）MDA（μmol/g）NOS（×103U/g）腎茶總黃酮小劑量組腎茶總黃酮大劑量組模型組對(duì)照組15 15 15 15 7.37±4.29 4.37±4.29*10.39±6.26△3.11±0.84 23.44±4.62 29.84±5.58*19.31±2.90△31.23±5.27 14.55±1.97 11.32±0.91*16.29±3.51△8.34±0.61 12.66±3.37 11.57±2.25*19.46±4.45△9.76±1.58

3 討論

細(xì)胞凋亡是由一定信號(hào)刺激引起，在基因調(diào)控下進(jìn)行自主程序化的細(xì)胞死亡，這個(gè)過程受到多種因素的影響，在正常生理或病理過程中均可發(fā)生，是機(jī)體維持細(xì)胞數(shù)量平衡和清除異常細(xì)胞的關(guān)鍵機(jī)制[6]。在缺血性腎損傷、藥物性腎損害、梗阻性腎臟病等各種急性腎損傷的病理過程中，TECs凋亡都發(fā)揮著重要的作用。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在各種有害刺激下，自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，表現(xiàn)為活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子產(chǎn)生過多和消除降低，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，生物膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白變性，DNA損傷，細(xì)胞的凋亡或死亡，組織受損[7～8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在急性腎缺血再灌注后，模型組腎組織內(nèi)NOS顯著升高，腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，導(dǎo)致腎功能發(fā)生異常。這表明TECs凋亡參與了急性缺血性腎衰竭的發(fā)生和進(jìn)展，其機(jī)制與腎組織內(nèi)自由基介導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)。

腎茶為唇形科植物貓須草的地上部分，具有利水消腫、利尿化石、養(yǎng)腎保腎、涼血止血等功效，因其悠久的應(yīng)用歷史和確切的治療功效，被越來越多的學(xué)者重視并進(jìn)行了深入的研究。現(xiàn)階段，經(jīng)眾多國內(nèi)外學(xué)者深入研究，已有200余種化合物自腎茶中經(jīng)提取分離得到，其中主要包括多甲基黃酮化合物、橙黃酮、澤蘭黃素等20多種黃酮類化合物。這些黃酮類化合物具有良好的抑制、清除自由基及抗氧化作用[9]，被廣泛用于治療急、慢性腎炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。

本實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)大劑量腎茶總黃酮治療后，實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織中SOD活性明顯增高，MDA和NOS水平明顯降低?？傊I茶總黃酮能夠減輕腎缺血再灌注損傷大鼠的急性腎損傷，這種作用可能與其升高大鼠腎組織內(nèi)SOD水平、降低MDA和NOS水平、抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。