中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)抗疣狀毛癬菌感染的作用研究

張秀軍 郭艷陽 朱振來 薛小文 馬翠玲 王剛 付萌

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，西安 710032)

中性粒細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要成員，在識別和清除真菌過程中起著不可或缺的作用，以往認(rèn)為中性粒細(xì)胞主要通過吞噬、脫顆粒作用來抵抗病原入侵[1]。然而對于體積太大而不能被吞噬的真菌細(xì)胞，中性粒細(xì)胞可以通過產(chǎn)生NETs的形式參與抗真菌免疫[2]。NETs是中性粒細(xì)胞在受到病原體刺激后，釋放出來的以細(xì)胞核解聚染色體構(gòu)成骨架，鑲嵌多種來自細(xì)胞內(nèi)的有殺菌作用顆粒蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些具有殺菌作用的蛋白主要包括瓜氨酸化的組蛋白H3(Citrullinated histon H3, Cit H3)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶(Neutrophils elastase, NE)、鈣防衛(wèi)蛋白等[3]。已有報道中性粒細(xì)胞通過形成NETs在抵御白念珠菌[4]、煙曲霉[5]等真菌免疫過程中發(fā)揮重要作用。

T.verrucosum感染常導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[6]，患者局部組織常見大量中性粒細(xì)胞浸潤[7-8]，可能參與機(jī)體抗T.verrucosum免疫，但具體機(jī)制不清。我們觀察到1例T.verrucosum感染患者局部組織大量中性粒細(xì)胞浸潤，但T.verrucosum能否誘導(dǎo)NETs形成及NETs是否參與抗T.verrucosum免疫還不清楚。我們首先觀察T.verrucosum感染患者組織及T.verrucosum感染小鼠組織中是否存在NETs，進(jìn)一步將T.verrucosum與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)觀察其是否誘導(dǎo)NETs的形成，并檢測NETs對T.verrucosum是否具有殺傷作用。

1 材料和方法

1.1 材料

儀器 激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國)；CFX384熒光定量PCR(BIO-RAD公司，美國)；比濁儀(生物梅里埃公司，法國)。

主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar, PDA)(美國BD公司)；Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；真菌DNA提取試劑盒與引物ITS1/ITS4合成(上海生工公司)；PMA(MedChemExpress公司，美國)；小鼠抗人MPO(ab25989)、兔抗人CitH3(ab5103)、兔抗小鼠NE(ab68672)抗體(Abcam，美國)；小鼠抗小鼠CitH3抗體(14269s,Cell Signaling公司，美國)；FITC-羊抗小鼠IgG抗體(CW0113，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);CY3-羊抗兔IgG抗體(EK022，西安壯志生物科技有限公司)；PKH26紅色熒光細(xì)胞標(biāo)記試劑盒、卡爾科弗盧爾熒光增白劑(SIGMA公司，美國)；SYTOX Green染料(賽默飛世爾公司，美國)；SYBR Premix Ex TaqII(TAKARA公司，日本)

實(shí)驗動物 8周齡雄性近交系BALB/C小鼠購買及飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗中心，培養(yǎng)于恒溫恒濕的SPF級屏蔽環(huán)境內(nèi)。

細(xì)胞 抽取健康志愿者外周血，通過密度梯度離心法提取中性粒細(xì)胞，無血清 RPMI培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞涂片吉姆薩染色，鏡下隨機(jī)選擇5個不同視野分析，純度為(94±2.92)%。血細(xì)胞計數(shù)儀調(diào)至濃度1×106/mL的細(xì)胞懸液備用。

1.2 方法

菌株制備 取患者毛囊內(nèi)容物進(jìn)行真菌培養(yǎng)，以PDA平板上培養(yǎng)的單個菌落進(jìn)行分子鑒定，采用上海生工公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，真菌特異性引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物送上海生工公司序列測定。測序結(jié)果顯示產(chǎn)物大小為611 bp，在PubMed上進(jìn)行blast比對鑒定為T.verrucosum。T.verrucosum接種于PDA試管培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14 d，加生理鹽水刷取菌落，液體加入研磨器充分研磨后使用比濁儀調(diào)濃度，分別制成麥?zhǔn)蠞岫?.0、4.0的菌液備用。

T.verrucosum感染患者組織NETs檢測 石蠟包埋患者組織切片脫蠟后經(jīng)熱處理修復(fù)抗原，山羊血清固定液固定，一抗用預(yù)混勻鼠抗MPO(1∶200)抗體與兔抗CitH3(1∶200)抗體，4℃濕盒過夜。PBS洗3遍，避光添加預(yù)混勻FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶200)和CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)，封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

T.verrucosum感染小鼠組織NETs檢測 現(xiàn)配制的濁度2.0T.verrucosum菌液500 μL注射小鼠背部皮下，1 d后脫頸椎處死，局部組織以10%福爾馬林固定過夜后石蠟包埋切片，染色及觀察方法同患者組織切片，其中，一抗用兔抗NE抗體(1∶400)和鼠抗CitH3抗體(1∶400)，二抗用CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶200)。

體外T.verrucosum誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs檢測 根據(jù)說明書用PKH26將中性粒細(xì)胞標(biāo)記為紅色，染色后細(xì)胞懸液每孔1 mL加入6孔板，添加100 μL濁度4.0T.verrucosum菌液，37℃、5%CO2孵育4 h后加入SYTOX Green(終濃度10 μmol/L)、真菌熒光染料Calcofluor White Stain(50 μL/mL)，5 min后激光掃描共聚焦顯微鏡觀察NETs的形成。

NETs殺傷T.verrucosum根據(jù)以往文獻(xiàn)報道[9]，中性粒細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，添加佛波酯(PMA)100 nmol/L，37℃、5% CO2孵育4 h誘導(dǎo)NETs。小心移去培養(yǎng)基，位于孔底的細(xì)胞層用2 mL PBS輕柔洗2遍，每孔加入RPMI 1 mL備用。在PMA誘導(dǎo)NETs的6孔板中，每孔加入濁度4.0菌液100 μL，空白孔中加等體積菌液與培養(yǎng)基作為陰性對照，每孔設(shè)3個復(fù)孔，37℃、5% CO2孵育24 h，重懸后離心，沉淀采用上海生工公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。根據(jù)以往文獻(xiàn)報道[10]，以ITS1/ITS4為引物，實(shí)時熒光定量PCR定量檢測，步驟參照SYBR Premix Ex TaqⅡ說明書，反應(yīng)終點(diǎn)讀取達(dá)閾值熒光量的循環(huán)數(shù)(Cq)，以對照組值為1，相對定量樣本中真菌數(shù)量，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計分析

用graphpad 8.0軟件統(tǒng)計分析及制圖，兩組間的均值比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

患者男，57歲，從事養(yǎng)殖業(yè)，因“面、頸部紅色丘疹、丘膿皰疹、瘙癢3個月”就診于我科。3個月前無明顯誘因患者面部、頸部出現(xiàn)紅色丘疹、丘膿皰疹，漸增多，伴瘙癢，部分胡須脫落。就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院未見好轉(zhuǎn)(具體診治不詳)?；颊咚曫B(yǎng)牛有脫毛、斑塊表現(xiàn)。既往史、個人史無特殊。系統(tǒng)檢查未見異常。皮膚科檢查：面、頸部見散在多個直徑約0.3 cm紅色丘疹，部分表面見膿皰，對稱分布，以口周、下頜胡須部位為著(見圖1a、b)。輔助檢查：血常規(guī)、肝功、腎功、血脂等未見明顯異常。刮取毛囊內(nèi)容物真菌鏡檢示：透明、分枝、分隔菌絲、鏈狀厚壁孢子(見圖1e、f，紅色箭頭示鏈狀厚壁孢子)。毛囊內(nèi)容物真菌培養(yǎng)：菌落在37℃比28℃生長更快(見圖1g、h)，起初質(zhì)地光滑，后絨毛狀，表面呈白色，邊緣為淡黃色(見圖1i)。真菌測序鑒定菌種為T.verrucosum?；颊咚曫B(yǎng)牛皮損刮片，體外培養(yǎng)真菌測序亦為T.verrucosum。左下頜丘疹處組織病理：Hematoxylin-eosin(HE)染色示毛囊口擴(kuò)張，真皮部分毛囊破壞，毛囊破壞處以及未破壞毛囊周圍大量中性粒細(xì)胞，少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(見圖1j、k)；Periodic Acid Schiff(PAS)染色：擴(kuò)張毛囊口見菌絲及孢子(見圖1l，黑色、紅色箭頭所指分別為菌絲、孢子)。

圖1臨床資料a和b：治療前；c和d：治療后；e和f：毛囊內(nèi)容物直接鏡檢(×400);gi:毛囊內(nèi)容物真菌培養(yǎng)，g、h和i分別為PDA 28℃培養(yǎng)3周，PDA 37℃培養(yǎng)3周，PDA 37℃培養(yǎng)2周；jl：組織病理(j、k和l分別為HE染色×25，HE染色×200，PAS染色×400)。

Fig.1Clinical data a and b: Before treatment. c and d: After treatment； e and f: Direct microscopic examination of hair follicle contents (×400)； gi: Fungi was cultured from hair follicle contents ( g, h and i respectivelyT.verrucosumcultured in PDA medium at 28 ° C for 3 weeks, cultured in PDA medium at 37 ° C for 3 weeks, and cultured in PDA medium at 37 ° C for 2 weeks)；jl: Histopathology ( j, k, and l were HE staining × 25, HE staining × 200, PAS staining × 400, respectively).

根據(jù)典型表現(xiàn)、組織病理、真菌體外培養(yǎng)及測序結(jié)果，診斷：須癬。予伊曲康唑膠囊0.2 g，每日2次口服，外用硝酸舍他康唑乳膏，2周后，根據(jù)真菌培養(yǎng)結(jié)果考慮可能為毛癬菌屬，伊曲康唑膠囊調(diào)整為鹽酸特比萘芬片250 mg，每日1次口服，5周后皮疹明顯好轉(zhuǎn)，3月后皮疹消退無復(fù)發(fā)，自行停藥(見圖1c、d) 。

2.2 T. verrucosum感染組織NETs檢測

對患者組織免疫熒光染色，檢測到與DNA共定位的NETs相關(guān)蛋白CitH3、MPO或NE，表明NETs形成(見圖2，白色箭頭所示)。同樣的，用T.verrucosum感染小鼠1 d的組織中可見明顯NETs。

圖2 免疫熒光檢測T. verrucosum感染患者(×40)及小鼠(×40 )組織NETs

2.3 T. verrucosum誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的效果

以T.verrucosum體外刺激中性粒細(xì)胞4 h，T.verrucosum被真菌熒光染料標(biāo)記成藍(lán)色(白色箭頭示菌絲)，且菌絲結(jié)構(gòu)清晰。中性粒細(xì)胞被PKH26標(biāo)記為紅色。SYTOX Green為不滲透細(xì)胞膜的核酸染料，中性粒細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的核酸被SYTOX Green標(biāo)記成綠色，并呈典型的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明T.verrucosum體外可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs形成。特別是，如黑色箭頭所指，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs主要聚集在菌絲周圍(見圖3)。

2.4 NETs對T.verrucosum的殺傷作用

T.verrucosum與NETs共孵育24 h，實(shí)時熒光定量PCR定量檢測NETs殺傷組與對照組真菌數(shù)量。結(jié)果顯示，與對照組比較，NETs殺傷組相對真菌數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

3 討 論

在發(fā)現(xiàn)NETs前，中性粒細(xì)胞如何殺傷真菌這一類無法吞噬的大型病原體一直是個謎。NETs的發(fā)現(xiàn)為認(rèn)識細(xì)胞外殺傷真菌提供了新途徑[11]。

圖3T.verrucosum誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs：T.verrucosum與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，免疫熒光檢測NETs的形成(×10)。圖4NETs對T.verrucosum的殺傷作用(**P< 0.01)

Fig.3Detection ofT.verrucosuminduced neutrophil production of NETs：T.verrucosumwas co-cultured with neutrophils for 4 h, immunofluorescence was used to detect the formation of NETs (×10).Fig.4Killing ofT.verrucosumby NETs(**P< 0.01)

研究證實(shí)，當(dāng)真菌入侵時，中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生NETs發(fā)揮清除真菌作用。我們在T.verrucosum感染患者組織中發(fā)現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤，提示T.verrucosum感染后，中性粒細(xì)胞通過聚集至感染灶，可能為形成NETs創(chuàng)造條件。通過檢測DNA及與NETs相關(guān)蛋白共定位，我們發(fā)現(xiàn)，T.verrucosum感染患者組織及T.verrucosum感染1 d后的小鼠組織存在明顯NETs。進(jìn)一步將T.verrucosum與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生明顯NETs，并呈典型的網(wǎng)狀形態(tài)。以上實(shí)驗表明，T.verrucosum可以有效誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。

NETs的網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)是其行使功能的基礎(chǔ)，用DNase破壞DNA骨架后，NETs的殺滅病原能力明顯下降[12]。值得注意的是，我們在體外誘導(dǎo)實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，NETs主要聚集在菌絲周圍，對菌絲呈包圍、籠絡(luò)趨勢。這體現(xiàn)了NETs控制真菌感染的重要途徑之一，也體現(xiàn)了胞外誘捕網(wǎng)獨(dú)特的功能，即通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞外形成對真菌的物理屏障，誘捕、綁定真菌，限制擴(kuò)散，阻止真菌感染進(jìn)展，有利于進(jìn)一步殺滅真菌，亦可能與其他聚集到感染灶的免疫細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用[2]。

捕獲入網(wǎng)后，除了物理屏障功能，由于主鏈上連接有磷酸二酯鍵，DNA本身就具有強(qiáng)力殺菌作用[13]。此外，NETs還通過強(qiáng)力抗菌蛋白在局部形成高濃度的殺菌環(huán)境等途徑發(fā)揮抗真菌作用[11]。在NETs殺傷T.verrucosum實(shí)驗中，我們用誘導(dǎo)的NETs與T.verrucosum共孵育。結(jié)果證實(shí)，NETs組較對照組相對真菌數(shù)量顯著降低，提示NETs對T.verrucosum有明顯的殺傷效應(yīng)。

綜上，我們的研究顯示T.verrucosum可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，NETs能夠有效地殺滅T.verrucosum，這為深入了解中性粒細(xì)胞清除T.verrucosum感染這一病理生理過程提供了依據(jù)。T.verrucosum誘導(dǎo)形成NETs的具體途徑與機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗研究。