14-3-3ζ蛋白在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及研究進(jìn)展

簡如麗，劉霆

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 長沙 410008）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的消化道腫瘤之一，我國所有癌癥中，HCC的發(fā)病率居于第4位，病死率居于第3位[1]，研究探索HCC新的診斷、篩查、治療及預(yù)測預(yù)后的生物學(xué)靶點(diǎn)十分重要。HCC的發(fā)生發(fā)展涉及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和組織微環(huán)境的改變等多種過程[2]。14-3-3ζ蛋白作為參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐蛋白，已被證實(shí)在HCC中存在過表達(dá)。作為致癌基因，14-3-3ζ的過表達(dá)可激活下游分子并激發(fā)HCC細(xì)胞的惡性潛能[3]。越來越多的證據(jù)表明14-3-3ζ在HCC的診斷、預(yù)后和化療耐藥性方面具有重要作用[4-5]。最近，Lin等[6]通過生物信息學(xué)分析，研究了14-3-3ζ在mRNA水平上對(duì)HCC的作用，他們發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ在HCC癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，另外，靶向14-3-3ζ的microRNA表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后改善存在相關(guān)性，這提示14-3-3ζ蛋白可能成為HCC的治療靶點(diǎn)。因此，14-3-3ζ蛋白作為一種重要的癌癥相關(guān)蛋白，在HCC的診斷、預(yù)后、化療耐藥性和治療等方面展現(xiàn)出越來越大的潛力，值得深入研究探索。

1 14-3-3ζ蛋白的生物學(xué)功能

1.1 14-3-3蛋白家族概要

1967年，Moore等[7]從牛腦勻漿中首次發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白。經(jīng)過幾十年的研究，對(duì)14-3-3蛋白的不同靶點(diǎn)及其細(xì)胞功能取得了較深的認(rèn)識(shí)。14-3-3蛋白家族是真核細(xì)胞表達(dá)的高度保守調(diào)控分子，分子質(zhì)量約為30 kD，共有7種亞型（β、γ、ε、ζ、η、σ、τ），分別由7種不同的基因編碼[8]，主要以同源/異源二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，二聚體狀態(tài)通常比較穩(wěn)定，Ser58的磷酸化會(huì)打破14-3-3蛋白單體和二聚體之間的平衡，導(dǎo)致二聚體的進(jìn)一步解離和單體的蓄積，這可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致14-3-3靶向通路的激活,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[9]。14-3-3蛋白缺乏蛋白酶活性，其與絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的胞內(nèi)蛋白相互作用，通過改變構(gòu)象、影響蛋白活性及復(fù)合物的穩(wěn)定性或改變亞細(xì)胞定位等多種方式調(diào)控靶蛋白，從而參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、增殖代謝、凋亡及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等多種生理過程[10]。研究[11]表明14-3-3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、關(guān)節(jié)炎癥、惡性腫瘤、感染性疾病、代謝性疾病等中均扮演了重要角色。

1.2 14-3-3ζ蛋白的功能

在14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ蛋白發(fā)揮腫瘤抑制作用,ζ、β、γ這3種亞型在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用[12]。其中，14-3-3ζ蛋白可結(jié)合包括晶狀體蛋白（αB-crystallin）、絲切蛋白、BAD、激酶、磷酸酶等在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)，是信號(hào)通路中重要的接頭蛋白，參與多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。14-3-3ζ蛋白在心臟疾病及中風(fēng)中可通過與血小板受體糖蛋白GPIb-IX-V形成復(fù)合體發(fā)揮抗血小板作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物14-3-3的7種亞型中，僅14-3-3ζ與代謝相關(guān)，在敲除14-3-3ζ小鼠中通過增加胰高血糖素樣肽1（GLP-1）水平增強(qiáng)口服葡萄糖耐量，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[14]。14-3-3ζ蛋白也參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[15]。此外，14-3-3ζ蛋白是目前廣為關(guān)注的新的抗腫瘤靶點(diǎn)，不僅在HCC、食管癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平均顯著升高，且作為多種癌癥診斷、復(fù)發(fā)、預(yù)后和化療耐藥性的潛在生物標(biāo)志物被廣泛研究[5]。

2 14-3-3ζ蛋白對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的影響

2.1 14-3-3ζ蛋白在HCC中的表達(dá)

多項(xiàng)研究[4，16-17]表明，HCC的發(fā)生發(fā)展與14-3-3ζ蛋白的異常表達(dá)密切相關(guān)，14-3-3ζ蛋白在HCC癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，與HCC細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移、化療耐藥性及不良預(yù)后等具有相關(guān)性。Tang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞中，14-3-3ζ蛋白可與乙型肝炎病毒蛋白X（hepatitis B virus protein X，HBx）結(jié)合并維持其蛋白穩(wěn)定性，Akt通路的激活參與了14-3-3ζ與pSer31-HBx之間的相互作用，且基因敲除14-3-3ζ的表達(dá)可抑制HBx的表達(dá)，提示14-3-3ζ可以作為治療HBV相關(guān)HCC的潛在靶點(diǎn)。另一研究[19]發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下HCC細(xì)胞中14-3-3ζ的穩(wěn)定高表達(dá)是由于14-3-3蛋白的泛素化水平下降。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)，在HCC患者中存在抗14-3-3ζ的自身抗體，并且在臨床確診HCC之前可以通過蛋白印跡觀察到血清中與14-3-3ζ的強(qiáng)的反應(yīng)條帶，抗14-3-3ζ的自身抗體可能是HCC的早期篩查和早期診斷潛在的生物學(xué)標(biāo)記物。HCC中存在14-3-3ζ蛋白的過表達(dá)，并且通過RNA干涉技術(shù)沉默或下調(diào)14-3-3ζ蛋白可抑制HCC細(xì)胞的增殖[16]。因此，14-3-3ζ蛋白的過表達(dá)在HCC的進(jìn)展中具有重要意義。

2.2 調(diào)控HCC細(xì)胞的增殖

14-3-3ζ蛋白在調(diào)控HCC細(xì)胞增殖方面有著重要的作用。14-3-3ζ蛋白可以與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的因子相互作用，激活相應(yīng)信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。

2.2.1 14-3-3ζ/血紅素氧合酶-1/STAT3通路血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)限速酶，HO-1及其酶產(chǎn)物在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、纖維化和血管生成等生物學(xué)過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ是新型的HO-1結(jié)合蛋白，二者的結(jié)合可抑制HO-1的泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解，從而促進(jìn)了HO-1的穩(wěn)定，過度的HO-1顯著增強(qiáng)IL-6誘導(dǎo)的STAT3活化，STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)，這些基因?qū)?xì)胞分化、增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，STAT3活性的失調(diào)與HCC的發(fā)生密切相關(guān)[20]，14-3-3ζ/HO-1軸可通過STAT3通路的調(diào)控作用于肝細(xì)胞增殖，導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展[21]。

2.2.2 14-3-3ζ與PI3K-Akt協(xié)同促進(jìn)HCC進(jìn)展14-3-3ζ誘導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路活化在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Tang等[22]對(duì)HCC及鄰近肝組織行組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)HCC患者中14-3-3ζ蛋白水平過表達(dá)，與P-Akt水平呈正相關(guān)性，并加速HCC異種移植腫瘤的生長和體內(nèi)誘導(dǎo)P-Akt/低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)。14-3-3ζ誘導(dǎo)Akt信號(hào)通路激活，導(dǎo)致HCC細(xì)胞增殖和存活，從而導(dǎo)致HCC的進(jìn)展。另外，14-3-3ζ和P-Akt的共同上調(diào)與衛(wèi)星結(jié)節(jié)、微血管浸潤、門靜脈癌栓相關(guān)，提示HCC患者預(yù)后不良。

另一研究表明通過RNA干涉技術(shù)抑制14-3-3ζ蛋白從而抑制HepG2 HCC細(xì)胞增殖，14-3-3ζ蛋白表達(dá)的減少可降低Huh-7細(xì)胞的致瘤性。此外，沉默14-3-3ζ蛋白可通過JNK和p38信號(hào)通路影響HCC細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，14-3-3ζ蛋白具有多方面的作用[16]。

2.3 調(diào)控HCC細(xì)胞遷移和侵襲

2.3.1 14-3-3ζ促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指細(xì)胞從上皮細(xì)胞通過特定的程序向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程[23]。在此過程中，上皮細(xì)胞失去了包括細(xì)胞極性及與基底膜的連接等表型，并獲得了遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)等能力[24-27]。研究表明，與許多其他癌細(xì)胞一樣，HCC細(xì)胞可通過EMT獲得間充質(zhì)特性，隨后癌細(xì)胞脫離原發(fā)病灶后侵入血管并在遠(yuǎn)處定植形成轉(zhuǎn)移性病灶[28]。

近年來有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ蛋白可以通過以下機(jī)制來促使HCC中的EMT的發(fā)生：⑴ Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)αB-crystallin與14-3-3ζ結(jié)合成復(fù)合物后增強(qiáng)了14-3-3ζ的穩(wěn)定性，并通過Erk1/2/Fra-1/slug信號(hào)通路激活誘導(dǎo)EMT過程，從而促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，并導(dǎo)致索拉菲尼耐藥性的增加；⑵ Axl是一種受體酪氨酸激酶，Reichl等[30]發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞中Axl/14-3-3ζ可導(dǎo)致Smad3L異常磷酸化和激活TGF-β腫瘤促進(jìn)靶基因，誘導(dǎo)TGF-β自分泌，導(dǎo)致EMT轉(zhuǎn)化水平上調(diào)，促使HCC細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，且HCC患者中Axl/14-3-3ζ的表達(dá)與血管侵犯和不良生存期相關(guān)；⑶ 缺氧誘導(dǎo)14-3-3ζ/HIF-1α/EMT通路。缺氧在HCC等實(shí)體腫瘤中很常見，Tang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)14-3-3ζ表達(dá)升高，與門靜脈癌栓形成相關(guān)，此外，14-3-3ζ可通過招募HDAC4上調(diào)HIF-1α表達(dá)，體外缺氧條件下，敲除14-3-3ζ可通過HIF-1α/EMT通路抑制缺氧誘導(dǎo)的侵襲。缺氧/14-3-3ζ/ HIF-1α通路在門靜脈癌栓的形成和HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且14-3-3ζ和HIF-1α的高表達(dá)是HCC患者預(yù)后不良的強(qiáng)有力的預(yù)測因子。因此，14-3-3ζ促進(jìn)EMT的發(fā)生的機(jī)制并不是單一的。

2.3.2 14-3-3ζ/磷酸化的Akt/FOXO3a通路一項(xiàng)研究表明，14-3-3ζ的高表達(dá)增強(qiáng)了Akt的磷酸化，磷酸化的akt主要通過促進(jìn)FOXO3a的磷酸化并與14-3-3ζ結(jié)合來抑制FOXO3a的活性，進(jìn)一步促進(jìn)磷酸化FOXO3a的核輸出，進(jìn)而促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和遷移。分子研究證實(shí)14-3-3ζ是miR-22的直接靶點(diǎn)，miR-22可通過抑制14-3-3ζ表達(dá)抑制其介導(dǎo)的AKT磷酸化促進(jìn)FOXO3a的核積累，進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲，從而增強(qiáng)FOXO3a在HCC中的抗腫瘤活性[32]。

綜上所述，14-3-3ζ的高表達(dá)導(dǎo)致的Akt信號(hào)通路激活，可引起HIF-1α高表達(dá)及磷酸化FOXO3a的核輸出，造成HCC的增殖及侵襲和遷移，但具體何種信號(hào)通路發(fā)揮主要作用，何種通路可成為抑制HCC進(jìn)展的主要靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步研究。

2.4 抑制HCC細(xì)胞凋亡

腫瘤的發(fā)生是由于腫瘤細(xì)胞的失控生長與過度增殖，從細(xì)胞凋亡的角度看，則是腫瘤細(xì)胞的各種凋亡機(jī)制受到抑制的結(jié)果。在細(xì)胞的凋亡過程中，14-3-3ζ以二聚體的形式與不同的靶蛋白結(jié)合，調(diào)控其定位和功能。

2.4.1 14-3-3ζ降低HCC的化療敏感性Choi等[16]研究發(fā)現(xiàn)在HCC中14-3-3ζ可通過調(diào)節(jié)c-Jun-NH(2)端激酶和p38/MAPK通路來影響順式二胺二氯鉑（cis-diammined dichloridoplatium，CDDP）的化學(xué)敏感性，結(jié)果顯示沉默14-3-3ζ可以抑制HCC生長并增強(qiáng)對(duì)CDDP的化學(xué)敏感性，從而增加肝HCC細(xì)胞凋亡。

2.4.2 14-3-3ζ的下調(diào)增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡另一研究[17]發(fā)現(xiàn)，通過抑制14-3-3ζ可以抑制細(xì)胞活力，并通過與Bax的相互作用增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而降低輻射耐藥性，肝臟腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（cancer stem-like cells，CSCs）中14-3-3ζ的下調(diào)可能會(huì)增加對(duì)γ放射(γ-irradiation，IR)的敏感性，并在IR暴露后顯著降低細(xì)胞存活率，在14-3-3ζ被敲除后，CSCs中IR后細(xì)胞凋亡率增加，從而導(dǎo)致抗輻射能力下降；此外，14-3-3ζ敲除增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在肝臟CSCs中存在大量裂解的細(xì)胞凋亡蛋白酶3和Bax。因此，14-3-3ζ可能通過抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)促進(jìn)分子如Bax的功能，從而抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展。

2.4.3 14-3-3ζ與ASK1作用抑制HCC細(xì)胞凋亡有報(bào)道[12]表明14-3-3蛋白家族可與ASK1相互作用而抑制HCC細(xì)胞凋亡。ASK1是一種促分裂原活化蛋白激酶，它的激活可導(dǎo)致JNK和p38介導(dǎo)的MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的發(fā)生，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ASK1可通過Ser-967與14-3-3ζ特異性相互作用，將ASK1隔離在細(xì)胞質(zhì)中，使其促凋亡功能受到抑制，促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

2.4.4 14-3-3ζ降低腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在HCC中的抗腫瘤活性HCC的惡性程度高，進(jìn)展快。Wang等[33]認(rèn)為在HCC中，14-3-3ζ的表達(dá)上調(diào)可通過抑制腫瘤浸潤T細(xì)胞的抗腫瘤功能來促進(jìn)HCC的浸潤轉(zhuǎn)移，他們研究結(jié)果顯示，在HCC細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TILs）中均存在14-3-3ζ的高度表達(dá)，且二者成正相關(guān)；與14-3-3ζ低表達(dá)組相比，14-3-3ζ高表達(dá)組的T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物（PD-1、TIM-3、LAG3、CTLA-4）的表達(dá)水平更高，這表明14-3-3ζ可導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的耗竭，這一發(fā)現(xiàn)證明了14-3-3ζ蛋白可降低TILs在HCC中的抗腫瘤活性。因此，HCC中14-3-3ζ蛋白可以通過抑制腫瘤免疫微環(huán)境中的T淋巴細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)來促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，但是該機(jī)制的研究太少，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3 總結(jié)及展望

HCC是肝臟最常見的惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[34]，病死率高，預(yù)后差[35]。14-3-3ζ作為腫瘤相關(guān)蛋白，在HCC中高度表達(dá)。14-3-3ζ蛋白可與αB-crystallin、HO-1、Bax、Axl等蛋白分子相互作用，可誘導(dǎo)p-Akt/HIF-1α、c-Jun-NH(2)端激酶和p38/MAPK通路、ASK1等信號(hào)通路，作為幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的中心樞紐參與HCC的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療耐藥，從而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。本文所述研究提示14-3-3ζ蛋白可能成為HCC的治療靶點(diǎn)，但目前僅有針對(duì)14-3-3蛋白的多肽抑制劑如R18和R18的二聚體（difopein)，但是由于缺乏亞型特異性，其在臨床上的應(yīng)用受到了限制[36-37]。另外，可通過RNA干涉或反義RNA靶向14-3-3ζ，使其沉默或降解，從而達(dá)到抑制腫瘤目的，但存在脫靶效應(yīng)[38]。目前也有關(guān)于14-3-3蛋白與靶蛋白相互作用的抑制劑BV02[39]以及14-3-3與配體相互作用的穩(wěn)定劑如殼梭孢素A[40]和環(huán)孢素A[41]等的研究。但直到目前為止，關(guān)于14-3-3ζ蛋白靶向治療的研究仍不成熟，仍需解決如14-3-3ζ抑制劑的載體及亞型特異性的藥物等諸多問題。14-3-3ζ蛋白在HCC中的作用使其有望成為早期篩查和診斷的潛在的生物學(xué)標(biāo)記物以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存分析的臨床預(yù)后標(biāo)記物，但其作為一種獨(dú)立的生物標(biāo)志物的特異性和敏感性也有待進(jìn)一步研究。通過探索14-3-3ζ在HCC中的多種作用機(jī)制，期許研發(fā)出特異的抑制14-3-3ζ生物學(xué)功能的藥物，為HCC的治療提供新的選擇。綜上所述，當(dāng)前的研究表明14-3-3ζ在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。14-3-3ζ蛋白在HCC的診斷、預(yù)后、化療耐藥性和治療靶點(diǎn)方面顯示出越來越大的潛力，具有重要的研究意義。期待能夠通過對(duì)14-3-3ζ蛋白在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制的研究來進(jìn)一步尋找可能的藥物治療靶點(diǎn)，從而為HCC患者的診斷治療提供新的選擇，使HCC患者獲得更好的臨床預(yù)后。